研究背景和目的： 结核病是全世界范围内最普遍的传染性疾病之一，由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起，严重威胁人类健康。目前，全世界已有三分之一约20亿人口感染了MTB，其中5％～10％的感染者发展成为活动性结核病，每年新发病人约900万，死亡人数高达200-300万。MTB为胞内寄生菌，其免疫主要是以CD4+ Th1细胞为主的细胞免疫。T细胞通过T细胞受体(T cell receptor, TCR)特异性地识别单核—巨噬细胞递呈的抗原，TCR分别由α/β或γ/δ两条多肽链通过二硫键连接而成的膜结合型异二聚体。其中α/β TCR在外周血中大约占95％，γ/δ TCR大约占5％。 类似于α、β链，TCR的γ和δ链分别由Vγ—Jγ—Cγ及Vδ—Dδ—Jδ—Cδ基因片段重排后编码，由此构成了具有不同特异性的γδ TCR分子。目前已检出14个Vγ基因(其中6个为假基因)和10个Vδ基因(其中4个为假基因)，5个Jγ，2个Cγ，3个Dδ，3个Jδ和1个Cδ片断。TCR重排过程中，V—(D)—J的基因片段进行重排并随机插入核苷酸形成—高度可变区，成为互补决定区3(CDR3)。通过对CDR3序列的分析，可作为判别T细胞克隆性的指标。 本研究主要对活动性结核病患者病变局部标本中特异性淋巴细胞TCRδ1和δ2链序列进行PCR扩增。扩增的产物进行克隆并测序，结果利用DNAstar、DANMAN软件及网上TCR资源分析比对，进而研究活动性结核病患者病变局部是否具有γ/δ T淋巴细胞的克隆性增殖，研究TCRδ1和δ2基因重排的特点及其CDR3区谱型分布，从而为进一步揭示γδ T淋巴细胞在结核感染与免疫中所起的作用及研究MTB特异反应性TCR四聚体奠定基础。 研究内容和方法： 分离活动性结核病人胸水(PLF)标本和外周血标本(PBMC)中的淋巴细胞，提取其总RNA，利用Switch Mechanism At5’—end of Reverse Transcript(SMART)逆转录获得全长cDNA，并通过LD—PCR合成第二链。根据GeneBank中已有的TCRδ链序列，分别设计三组引物扩增TCRδ链的V区、CDR3区以及C区。其中V区的上游引物应能包括TCRδ链先导序列起始密码，下游引物则根据V区相对保守序列设计；CDR3区的上游引物根据V区的相对保守序列设计，下游引物根据C区保守序列设计；C区的上下游引物根据C区保守序列设计(下游引物包括终止密码)，同时在V区上游引物、C区下游引物分别引入相应的酶切位点。然后利用Overlap—PCR技术将TCRδ链的V区、CDR3区、C区拼接成完整的TCRδ全长编码序列。PCR回收产物连接pGEM—Teasy载体，蓝白筛选得到阳性克隆，委托公司测序。测序结果用DNAMAN软件及网上资源进行分析、比对，研究TCRδ链的CDR3碱基及氨基酸序列，得到不同的TCRδ链等位基因。将得到的不同等位基因去除TCRδ链跨膜区和胞内区编码序列，然后在C端连入编码亲水性氨基酸编码序列和生物素化酶底物基因，克隆入表达载体pMT/V5/His—A构建分泌表达重组载体，与γ链分泌表达重组载体及BirA表达载体共转染S2细胞后以生物素化的二聚体的形式分泌表达于胞外。 结果： 本实验分别从10例活动性肺结核患者胸水标本和1例外周血标本中扩增出了完整的TCRδ链编码序列，总共得到不同的δ2链基因型37个，δ1链基因型30个。 序列分析结果：将各序列通过网上TCR资源进行分析后，我们可以看到δ1链的V区主要是DV1*01；J区以DJ1*01为主，只有两个序列的J区是DJ3*01；D区以DD3*01为主，有一部分序列的D区则同时包含DD2*01与DD3*01，有两个序列的D区同时包含DD1*01和DD3*01。δ2链的V区主要是DV2*01；J区以DJ1*01和DJ3*01为主；D区以DD3*01为主，有一部分序列的D区则既包含DD2*01又包含有DD3*01，在我们所扩增到的所有序列中，只有一个序列的D区是DD1*01。并且，在δ2链、δ1链的V区与J区之间均有N区、P区的插入。 氨基酸序列分析显示同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性，但是各病例之间也发现有一些相同或相似的氨基酸序列：标本6、7、10具有相同的δ1链CDR3氨基酸序列：ALGELPSAFIYVHDKLI；标本3、6具有相同的δ1链CDR3氨基酸序列：ALGERYGTGGYHTDKLI；标本2、6具有相同的δ2链CDR3氨基酸序列：ACDTVDREGSWDTRQMF；标本2、4、5、7、8、9具有相同的δ2链CDR3氨基酸序列：ACDSVLGDT RSWDTRQMF；标本5、8、9具有相同的δ2链CDR3氨基酸序列：ACDSLGDNADKLI；标本7、9具有相同的δ2链CDR3氨基酸序列：ACDTLGDTSSWDTRQMF； 结论： 1.研究中采用SMART和LD—PCR的技术方法克服样本量小的问题，利于对一份样本进行多个方面的研究。 2.设计引物分别扩增TCRδ1、δ2链的V区、CDR3区及C区，采用Overlap—PCR方法将三者拼接为完整的编码序列，减少了γδ TCR基因扩增的困难。 3.序列分析提示结核患者病变局部存在γδT细胞的克隆性增殖。克隆增殖的γδ TCR CDR3氨基酸序列呈现多样性，但是在同一患者及不同患者之间具有一些相同的CDR3氨基酸序列，提示这些相同的氨基酸序列对于识别MTB抗原可能具有特异性。 4.获得的MTB反应性TCR8基因克隆为进一步研究MTB特异反应性γδTCR四聚体建立了基础。