【摘 要】
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当植物受到盐碱等非生物胁迫时,其正常生长发育及其生理代谢水平会受到影响。蓖麻（Ricinus communis L.）作为内蒙古通辽市的特色油料作物,近年来因盐碱地面积不断扩大对蓖麻的产量与质量产生了很大影响,因此通过挖掘蓖麻耐盐基因选育蓖麻耐盐新种质具有现实意义。泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system）是目前已知细胞内蛋白降解的有效途径,而泛素结合酶（Ubiqu
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当植物受到盐碱等非生物胁迫时,其正常生长发育及其生理代谢水平会受到影响。蓖麻（Ricinus communis L.）作为内蒙古通辽市的特色油料作物,近年来因盐碱地面积不断扩大对蓖麻的产量与质量产生了很大影响,因此通过挖掘蓖麻耐盐基因选育蓖麻耐盐新种质具有现实意义。泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system）是目前已知细胞内蛋白降解的有效途径,而泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme,UBC）作为“桥梁”在其中发挥着重要作用。为了揭示蓖麻中泛素结合酶的功能,本研究参考蓖麻种子萌发期盐胁迫的转录组数据库,挑选出上调表达基因RcUBC19与Rc UBC38,对其进行克隆;并通过生物信息学分析预测蛋白质的结构及功能;利用q RT-PCR对不同盐胁迫处理下蓖麻苗期根、茎、叶中该基因的表达量进行测定;构建植物过表达载体与CRISPR/Cas9编辑载体,转入蓖麻中进行相关生理指标的测定。主要结果如下:以“哲蓖3号”蓖麻的c DNA为模板,设计特异性引物,利用PCR技术克隆得到两个泛素结合酶基因的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,大小分别为540 bp和846 bp,命名为RcUBC19与Rc UBC38。生物信息学分析结果表明,RcUBC19与Rc UBC38蛋白分别含有179个和281个氨基酸残基;蛋白质分子质量分别为19.772 k Da和32.303 k Da;等电点为5.21和5.06;Rc UBCs基因编码的蛋白均含有泛素结合酶的保守区;Rc UBCs蛋白的氨基酸序列中没有跨膜结构,均为非跨膜蛋白;蓖麻RcUBC19与Rc UBC38氨基酸序列分别与巴西橡胶树和麻枫树氨基酸序列的同源性最高;RcUBC19与Rc UBC38蛋白二级结构预测分别是无规则卷曲与α-螺旋的占比最大,三级结构预测与二级结构一致。利用q RT-PCR技术对RcUBC19与Rc UBC38基因在不同盐胁迫处理下蓖麻组织的结果显示,泛素结合酶RcUBC19基因的表达量:根＞叶＞茎。随着盐处理时间的延长,茎与叶的表达量呈先升后降的趋势。根部和叶部在12 h的表达量最高且显著高于0 h;茎部的表达量在6 h达到最高,在24 h几乎不表达,推测该基因主要在根部参与逆境防御反应。Rc UBC38基因的表达量:叶＞茎＞根。Rc UBC38基因随着盐处理时间的延长,根部、茎部的表达量均下降,分别在6h、24 h达到最低,与0 h差异极显著;叶部在6 h的表达量最高且显著高于0h。总之,盐胁迫上调了基因的表达水平。构建植物过表达载体与CRISPR/Cas9编辑载体,根癌农杆菌EHA105转化蓖麻子叶节,EHA105-p CG1300-RcUBC19转化外植体4452株,PCR检测后获得18株阳性苗,转化率为0.4%。EHA105-p CG3300-Rc UBC38转化外植体3859株,PCR检测获得12株阳性苗,转化率为0.31%。EHA105-Rc UBC38-g12转化外植体2565株,得到待检测植株后进行PCR检测获得9株阳性苗,转化率为0.35%。选取200 mmol/L NaCl盐胁迫不同时间段（0 h、8 h、24 h）蓖麻的叶片进行生理指标Na+、K+、MDA含量,SOD、CAT活性和电导率REL的测定。结果表明,过表达转基因植株的Na+含量显著低于“哲蓖3号”蓖麻植株,K+含量显著高于“哲蓖3号”蓖麻植株。K+/Na+比值转基因植株仍高于野生型,转基因植株受损伤程度较小。丙二醛MDA含量发生变化,表明植物在遭受盐胁迫时受到伤害。CAT和SOD活性总体呈上升的趋势,CAT和SOD可能参与蓖麻自身修复过程,对胁迫时的损伤有缓解作用。在非盐胁迫条件下,各转基因株系与“哲蓖3号”蓖麻的相对电导率差异不显著。盐胁迫来临时,各株系的相对电导率随着盐胁迫时间的延长均呈上升趋势,但转基因蓖麻的相对电导率均小于对照。而且转基因蓖麻与非转基因对照蓖麻间的相对电导率差异达到显著水平,转基因蓖麻细胞电解质外渗量小,细胞膜稳定性较“哲蓖3号”蓖麻高。总的来说,Rc UBCs基因的导入提高了转基因蓖麻的耐盐性。CRISPR/Cas9编辑Rc UBC38基因植株的结果与过表达结果正好相反,结果显示,编辑型蓖麻不如“哲蓖3号”蓖麻对盐的耐受性强。Rc UBC38基因的编辑降低了转基因蓖麻的耐盐性。综上,RcUBC19与Rc UBC38基因可能提高了蓖麻对盐胁迫的耐受性。本研究为RcUBC19与Rc UBC38基因的进一步应用及系统揭示泛素结合酶的功能提供理论依据。
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