【摘 要】
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丝裂原活化蛋白激酶MAPKs（Mitogen-activated protein kinases）是真核生物普遍表达的一类蛋白,它们属于丝/苏氨酸激酶,在细胞应答过程中起关键调控作用。MAPK信号级联通路由三部分组成:MAP3K（MAPK kinase kinase,MEKK）,MAP2K（MAPK kinase,MKK 或 MEK）和 MAPK,其中植物的 MAPKs又称为MPKs。MAP3Ks
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丝裂原活化蛋白激酶MAPKs（Mitogen-activated protein kinases）是真核生物普遍表达的一类蛋白,它们属于丝/苏氨酸激酶,在细胞应答过程中起关键调控作用。MAPK信号级联通路由三部分组成:MAP3K（MAPK kinase kinase,MEKK）,MAP2K（MAPK kinase,MKK 或 MEK）和 MAPK,其中植物的 MAPKs又称为MPKs。MAP3Ks、MKKs和MAPKs通过逐级磷酸化方式被激活,共同调节细胞的分裂和发育过程。当细胞受到外界刺激时,MKKs能够磷酸化MAPKs活化环的苏/酪氨酸,而特定的磷酸酶也能去磷酸化MAPKs。目前,对于MAPKs结构和调控机制研究主要集中于哺乳动物的同源蛋白,而对于植物中的MAPK信号通路知之甚少,特别是在MPKs的活化机制上。拟南芥MPK4/12与气孔响应有关,现如今对于AtMPK4/12的结构研究较少,其活化机制仍有待阐明。本课题针主要运用生化和结构生物学方法研究AtMPK4/12的活化机制。通过上游激酶AtMKK1/7/9磷酸化下游底物AtMPK4/12,以此来制备磷酸化的AtMPK4/12,然后进行蛋白质结晶实验,期望能够获得磷酸化的AtMPK4/12晶体结构,了解AtMPK4/12活化机制,为后续MAPK信号通路研究提供新思路。拟南芥MPK4/12与气孔响应有关,现如今对于AtMPK4/12的结构研究较少,其活化机制仍有待阐明。（1）构建AtMKK1/7/9野生型和四种模拟磷酸化突变体克隆,经大肠杆菌表达后,通过蛋白纯化的方法对其进行纯化,能够获得AtMKK1/9蛋白但无法得到AtMKK7蛋白;（2）通过蛋白质相互作用分析、Western Blot和酶活力测定的方法对AtMKK1/9催化AtMPK4/12磷酸化反应进行测定,发现AtMKK1能够磷酸化AtMPK4活化环的苏氨酸和酪氨酸,而AtMKK9可能不能有效磷酸化AtMPK12活化环的苏氨酸和酪氨酸;（3）通过AtMKK1/7/9共转AtMPK4/12的方式,发现AtMKK1/7/9能够磷酸化AtMPK4/12活化环的苏氨酸和酪氨酸;（4）选择最优方法制备磷酸化的AtMPK4/12,进行结晶条件的筛选,并成功获得了磷酸化的AtMPK12晶体。
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