【摘 要】
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研究目的:肠易激综合征（Irritable bowel syndrome,IBS）是一种常见的慢性功能性胃肠道疾病,以腹痛、腹胀和排便习惯改变为主要临床表现,无胃肠道结构和生化指标的异常。IBS患者约占世界人口的11%,因其发病机制复杂多样,目前临床上缺乏有效的治疗手段。慢性内脏痛是其常见的症状之一,严重影响人们的生活质量。鉴于IBS的临床负担,探讨慢性内脏痛的发病机制具有重要意义。外泌体是大多数
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研究目的:肠易激综合征（Irritable bowel syndrome,IBS）是一种常见的慢性功能性胃肠道疾病,以腹痛、腹胀和排便习惯改变为主要临床表现,无胃肠道结构和生化指标的异常。IBS患者约占世界人口的11%,因其发病机制复杂多样,目前临床上缺乏有效的治疗手段。慢性内脏痛是其常见的症状之一,严重影响人们的生活质量。鉴于IBS的临床负担,探讨慢性内脏痛的发病机制具有重要意义。外泌体是大多数细胞都能分泌的大小为30～150 nm的微囊泡,参与慢性疼痛的发生发展。本实验旨在探讨前扣带回皮层（Anterior cingulate cortex,ACC）Rab27a（Ras-related protein Rab-27a）介导外泌体释放在新生期母爱剥夺（Neonatal maternal deprivation,NMD）小鼠慢性内脏痛中的作用机制。实验方法:1.动物模型建立:正常孕鼠生育后,从第二天将母鼠和子鼠定时定点每天分离3 h,连续14天,以此诱导新生期母爱剥夺（NMD）模型。分离结束后,幼鼠放回母鼠身边。2.行为学检测:使用热刺痛仪检测小鼠热刺激缩足反应潜伏期（Paw withdrawal latency,PWL）,通过尼龙纤维丝针（Von frey filaments,VFF）的方法检测小鼠机械性缩足反射频率（Paw withdrawal frequency,PWF）,通过结直肠扩张（Colorectal distention,CRD）的方法检测小鼠结直肠疼痛阈值,使用小鼠转棒仪（Rotarod）检测小鼠的运动功能状态。3.外泌体的鉴定与定量:运用超速离心法提取外泌体,运用电镜观察外泌体形态学结构,运用BCA试剂盒量化外泌体的蛋白浓度,运用Western blotting技术检测ACC区外泌体特异性蛋白标记物（CD9、CD63和CD81）的表达情况。4.分子表达检测:运用RT-qPCR和Western blotting方法检测ACC中Rab27a在mRNA和蛋白水平上的表达情况,运用免疫荧光技术检测ACC中Rab27a的细胞定位分布。5.细胞转染实验:运用细胞转染实验筛选敲降Rab27a分子表达效果最好的siRNA。6.ACC核团内微量注射:ACC内微量注射外泌体抑制剂GW4869或溶剂Vehicle检测小鼠疼痛行为。ACC内微量注射siRNA-Rab27a或siRNA-NC检测小鼠疼痛行为以及ACC内Rab27a的蛋白表达水平。实验结果:1.与CON小鼠相比,NMD小鼠ACC区外泌体的数量显著增多。2.分离提取NMD小鼠ACC区外泌体,将其脑立体定位注射至CON小鼠ACC区,可以诱导小鼠产生内脏痛敏。3.与CON小鼠相比,NMD小鼠ACC区Rab27a的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。Rab27a主要表达于神经元中,几乎不表达于星形胶质细胞和小胶质细胞。与CON小鼠相比,NMD小鼠ACC内Rab27a 阳性神经元比例显著升高。Rab27a主要表达于兴奋性神经元中。与CON小鼠相比,NMD小鼠ACC内Rab27a 阳性兴奋性神经元比例显著升高。4.ACC内微量注射外泌体抑制剂GW4869后,能够显著缓解NMD小鼠的内脏痛敏。ACC内微量注射siRNA-Rab27a可显著减少ACC区外泌体的释放量,缓解NMD小鼠的内脏痛敏。研究结论:本实验结果初步表明,NMD小鼠ACC区神经元Rab27a的表达上调,介导ACC区外泌体的释放量增多,从而诱导NMD小鼠产生内脏痛敏。上述实验结果表明调控外泌体释放可能是治疗慢性内脏痛的一个新靶点。
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