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肝细胞癌（HCC）是世界范围内常见的恶性肿瘤,在我国居肿瘤死因第二位,缺乏有效的早期诊断标志物是HCC高死亡率重要因素。因此,探寻灵敏度高、特异性强、检测方便的早期诊断标志物具有重要意义。肿瘤标志物的发现是代谢组学的重要应用领域。血液中代谢物丰富且临床样本易得,因此血液是生物标志物研究的最佳样本。代谢物的变化被认为是肿瘤的特征之一,并且肿瘤细胞的代谢重编程对其快速增殖很重要,因此通过研究HCC患者血清代谢物的变化,有望找到理想的早期诊断标志物及新的药物靶标。代谢组学是通过高通量的分析技术识别、定量和表征生物系统中内源性小分子代谢物（分子量<1800 Da）的学科。根据研究目的和分析技术的不同,代谢组学研究分为靶向、非靶向及拟靶向三种。靶向代谢组学通常应用基于多反应监测（MRM）的质谱技术对几个或几类已知的与生物学事件相关的代谢物进行分析,利用标准品对生物样本中的目标代谢物进行绝对定量,具有较强的针对性,且定量准确度和灵敏度高。非靶向代谢组学不限定测定的代谢物种类,目的是尽可能多的检测并定性定量代谢物。本研究对42例HCC患者,41例肝硬化（LC）患者及30例健康对照（NC）人的血清分别进行了靶向及非靶向代谢组学研究。靶向代谢组学关注的26个小分子代谢物涉及糖酵解、三羧酸（TCA）循环、甘氨酸和丝氨酸代谢。本实验室前期的蛋白质组及激酶组研究表明HCC发展过程中与这些通路相关的多个蛋白质显著变化。代谢通路变化会导致某些小分子代谢物变化而具有疾病指示作用。靶向代谢组学研究建立了反相液相色谱-多反应监测-质谱（RPLC-MRM-MS）技术,应用该技术对26个小分子代谢物进行了绝对定量。经多元统计分析,确定了6个潜在的生物标志物,分别是衣康酸、肌氨酸、甘油酸、富马酸、柠檬酸和异柠檬酸。应用单变量和多变量受试者特征曲线（ROC）分析进行了生物标志物分析和性能评价,找到了三组潜在的候选生物标志物,其中AFP、肌氨酸和衣康酸作为一个诊断的生物标志物组可区分HCC和LC患者,该生物标志物组的曲线下面积（AUC）为0.87,灵敏度为76%,特异性为86%,并且该代谢标志物组的诊断性能明显优于AFP;柠檬酸、异柠檬酸、衣康酸和富马酸作为一个诊断的生物标志物组可区分HCC和NC患者,该生物标志物组的AUC为0.92,灵敏度为76.7%,特异性为76.2%;异柠檬酸、肌氨酸、衣康酸、柠檬酸和DL-甘油酸作为一个诊断的生物标志物组可区分LC和NC患者,该生物标志物组的AUC为0.99,灵敏度为96.7%,特异性95.1%。非靶向代谢组学研究应用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-QTOF-MS/MS）技术对血清代谢物进行鉴定和定量。液相色谱分离采用反相色谱（RPLC）和亲水相互作用色谱（HILIC）,质谱采集包括正负两种离子化方式,因此每个样本用四种方式进行分析,简称RPLC-POS、RPLC-NEG、HILIC-POS和HILIC-NEG模式。应用Progenesis QI软件进行数据处理,EZinfo进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和单因素方差分析（One-way ANOVA）等多元统计方法,结合变量重要性投影指标（VIP）、p值及变化倍数（FC）筛选差异代谢物。代谢物鉴定通过检索人代谢组数据库（HMDB）和Metlin数据库实现。应用Metabo Analyst5.0对差异代谢物进行代谢通路分析。基于UPLC-QTOF-MS/MS技术,113个血清样本中共检测到42723个特征代谢峰,鉴定出4914种代谢物。根据p<0.05,VIP＞1,FC≥1.5或≤0.67三个条件,共筛选到758个差异代谢物,其中HCC vs.LC,HCC vs.NC及LC vs.NC组间差异代谢物分别为249、510和534个,主要包括磷脂、胆汁酸、游离脂肪酸（FFA）、小肽和氨基酸等,分别涉及5、12及11个变化显著的代谢通路,包括甘油磷脂代谢、硫代谢、鞘磷脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸转化、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、亚油酸代谢和苯丙氨酸代谢等途径。对组间最显著的20个差异代谢物进行了ROC分析,其中PG（i-12:0/a-17:0）和植物鞘氨醇/PG（i-12:0/a-17:0）的比值是HCC与LC之间两组鉴别性能优异的潜在生物标志物;正缬氨酸和L-组氨醇是HCC与NC之间两组鉴别性能优异的潜在生物标志物;L-组氨醇/3-羟基辛酰肉碱的比值和N-二十二碳六烯酰基-4-氨基丁酸/肌苷的比值是LC与NC之间两组鉴别性能优异的潜在生物标志物。综上所述,本课题应用LC-MS技术,经靶向和非靶向代谢组学研究,确定了能够用于HCC及LC早期诊断的多组潜在生物标志物。研究表明,靶向与非靶向代谢组学技术各有优点,相互补充,结合两种研究方式,能够获得更多潜在生物标志物。另外,应用非靶向代谢技术鉴定了近5000个代谢物,表明RPLC结合HILIC分离的UPLC-QTOF-MS/MS技术能显著提高代谢物的鉴定覆盖率,可广泛应用于多领域的代谢组学研究。