【摘 要】
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冷冻干燥是保存微生物最常用的方法之一,但在冷冻干燥过程中,菌株在不同条件下会不可避免地受到不同程度的损害。其中,细胞膜完整性的破坏是损伤的主要形式之一。而细胞膜中脂肪酸的类型和比率会影响到它的特性。因此,某些脂肪酸是否能提高菌株的冷冻干燥抗性值得研究。本研究以6株植物乳杆菌为研究对象,探究油酸对其冷冻干燥存活率的影响,利用基因敲除技术进一步验证,并解析油酸对植物乳杆菌冷冻干燥损伤的保护机制。得到的
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冷冻干燥是保存微生物最常用的方法之一,但在冷冻干燥过程中,菌株在不同条件下会不可避免地受到不同程度的损害。其中,细胞膜完整性的破坏是损伤的主要形式之一。而细胞膜中脂肪酸的类型和比率会影响到它的特性。因此,某些脂肪酸是否能提高菌株的冷冻干燥抗性值得研究。本研究以6株植物乳杆菌为研究对象,探究油酸对其冷冻干燥存活率的影响,利用基因敲除技术进一步验证,并解析油酸对植物乳杆菌冷冻干燥损伤的保护机制。得到的主要结论如下:1)在培养基以及保护剂中添加低浓度油酸可以提高植物乳杆菌菌株的冷冻干燥存活率,并确定保护剂中添加油酸的最佳浓度为0.001%。在PBS、山梨醇和蔗糖的条件下,培养基中添加1 g/L油酸分别可使植物乳杆菌的冷冻干燥存活率提高6.63、5.35和2倍,保护剂中添加0.001%的油酸分别可使植物乳杆菌的冷冻干燥存活率提高6.63、3.65和2.26倍,并且在蔗糖条件下添加油酸,植物乳杆菌的冻干存活率可达到90%左右。虽然油酸的保护作用效果取决于所使用的保护剂以及菌株的类型,但总体上均有显著的改善（P＜0.05）。当将可为菌株提供油酸的吐温80和吐温20添加到培养基中培养菌株时,菌株的冷冻干燥存活率也显著提高（P＜0.05）。结果表明,油酸的外源添加可以显著提高植物乳杆菌的冷冻干燥存活率。2)为进一步验证油酸在冷冻干燥中的保护作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行C18:1 cis-9（油酸）合成的关键基因—cla-er基因的敲除。敲除此基因,能阻断油酸的合成。通过测定野生型菌株和敲除型菌株的冷冻干燥存活率发现,cla-er基因的敲除会使植物乳杆菌的冷冻干燥存活率显著降低（P＜0.05）。而使用添加0.001%油酸的保护剂处理敲除型菌株可使其冷冻干燥存活率恢复到野生型水平。进一步证明了油酸在植物乳杆菌冷冻干燥中的重要性。3)为解析油酸对植物乳杆菌冷冻干燥保护作用的原因,对菌株的细胞膜完整、LDH酶活、PK酶活以及细胞膜脂肪酸进行了测定。结果表明,保护剂中添加0.001%的油酸是通过维持细胞膜完整性和乳酸脱氢酶（LDH）活性来提高植物乳杆菌的冷冻干燥存活率,而PK酶活性变化并不是影响菌株冷冻干燥存活率的关键。此外,脂肪酸的测定结果表明,油酸的外源添加会使得菌株细胞膜脂肪酸中的C18:1 cis-9（油酸）增加12%～17%;吐温添加类型也会对细胞膜脂肪酸的组成和相对含量产生影响,添加吐温80和吐温20可以为菌株提供C18:1 cis-9;而cla-er基因的敲除造成了菌株细胞膜脂肪酸中C18:1 cis-9的消除,说明油酸的存在以及含量也是导致菌株冷冻干燥存活率发生变化的因素之一。综上,目前常用低温保护剂来保护细菌,我们的研究通过添加一种常见的食品成分,为保护细菌活力提供了一种新的策略,并且具有用量少、成本低的特点,可以广泛应用于食品行业。研究还通过不同手段解析了油酸对菌株冷冻干燥损伤的保护机制,为油酸作用机理的研究提供了一定的理论基础。
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