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正畸治疗过程中,矫治力产生的机械刺激导致局部骨组织吸收与重建,最终导致牙在牙槽骨中位置的移动。作为骨代谢的重要调节因素,机械力学刺激在骨自稳态平衡中发挥重要作用。多种细胞参与了局部的骨改建过程,其中,活跃的成骨细胞是骨表面重要的力学刺激感受细胞,也是新骨形成的最终效应细胞。在发育完成的个体体内,成骨细胞不具备增殖能力,主要来源于包括BMSCs在内的多能干细胞分化。作为目前最常用的组织工程细胞之一,BMSCs具有很强的自我更新能力和多向分化潜能,同时也是一种应力敏感细胞。机械力可影响其功能状态并诱导其向骨系细胞分化。研究表明,张应力引起的BMSCs的活化是局部牙槽骨改建的关键因素。近年来,随着牵张力与BMSCs成骨分化的研究日趋成熟,其分子调控机制成为研究热点。 MicroRNAs是一类存在于真核生物体内,长约22-25bp的内源性非编码单链RNA分子,通过与靶基因的特异性碱基配对引起靶序列降解或翻译阻遏,从而对靶基因的表达进行转录后水平的调控。miRNAs参与肿瘤细胞行为、细胞“干性”维持及各向分化等各种调控过程。随着研究的不断深入,miRNAs在BMSCs成骨分化过程的调控作用也逐渐被揭示。研究发现miRNA-335-5p能够直接对Wnt通路抑制剂DKK1产生负性调控作用,从而促进C3H10T-1/2、MC3T3-E1、MLO-A5、MLO-Y4等多种系成体干细胞的成骨向分化过程。miR-29b则通过下调成骨分化抑制因子(如HDAC4,TGF3,ACVR2A等)的表达水平从而促进成骨分化。然而在应力诱导的成骨过程中,miRNA对BMSCs成骨分化的作用及调控机制仍需进一步研究。因此,本实验通过miRNA芯片寻找在成骨分化中应力敏感的miRNA,并对其在周期性牵张力诱导的成骨分化中的作用及机制进行初步研究。 目的: 本课题通过构建rBMSCs体外培养—力学刺激模型,从细胞及分子生物学角度,探索miRNA在周期性牵张力诱导rBMSCs成骨分化中的表达谱变化,并进一步研究miR-503-5p的调控功能,阐明临床正畸治疗过程局部骨改建机制。 方法: (1)rBMSCs的体外分离培养及干性鉴定。 (2)建立rBMSCs体外加力模型,筛选周期性牵张力诱导rBMSCs成骨分化的最适条件。 (3)采用最适条件对细胞加载周期性牵张力,利用miRNA芯片进行差异性表达miRNA筛选。qRT-PCR验证芯片结果,并结合相关文献确定进一步拟研究miR-503-5p。 (4)探究miR-503-5p在成骨分化过程中的表达模式,并利用miR-503-5p mimics/inhibitor瞬时转染rBMSCs,qRT-PCR、Western blot分别检测成骨相关因子ALP、Runx2 mRNA及蛋白水平表达变化,对其功能进行验证。 结果: (1)成功分离培养rBMSCs,流式细胞术结果显示P3代rBMSCs表型特征:CD44、CD90(+),CD34、CD45(-),符合实验要求。成骨诱导28天后茜素红染色可见钙结节生成,成脂诱导28天后油红O染色可见脂滴形成。 (2)成功构建rBMSCs体外加力模型,ALP活性检测结果显示最适应力加载条件为:频率1Hz,幅度10%,时间12h。 (3)miRNA芯片结果显示,三组样品中,加力组与对照组相比表达差异具有统计学差异的miRNA共9个,表达上调者2个,下调者7个。大部分差异miRNA的qRT-PCR验证与芯片结果基本保持一致。 (4)miR-503-5p在周期性牵张力诱导rBMSCs成骨分化过程中的表达具有时间依赖性,加力12h表达量最低(p<0.01)。rBMSCs转染miR-503-5p mimics后,ALP、Runx2mRNA及蛋白水平表达降低,转染miR-503-5p inhibitor后ALP、Runx2 mRNA及蛋白水平表达升高。 结论: (1)应用miRNA芯片发现周期性牵张力诱导rBMSCs成骨分化过程中,9个miRNA表达变化显著,具有统计学意义,其中miR-503-5p差异最为显著; (2)miR-503-5p抑制周期性牵张力诱导rBMSCs成骨分化过程。