CDPKs在乙烯诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与H2O2和NO的关系

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钙依赖性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)是植物细胞信号转导途径第二信使Ca2+的一种传感器,可以作为直接的“传感器兼应答器”来解码Ca2+信号,实现对植物生长发育的调控和外界刺激的响应。模式植物拟南芥中有34种CDPKs。前人研究表明多种CDPKs参与许多生物和非生物刺激因子调控气孔运动的信号转导,包括ABA、水杨酸(SA)、茉莉酸(MeJA)和病原激发子等。外源乙烯不仅能诱导气孔关闭,同时内源乙烯还可以介导其它激素如水杨酸和油菜素内酯诱导的气孔关闭;相反,乙烯介导的信号转导途径却抑制ABA诱导的气孔关闭。前人研究表明在乙烯诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程中,启动了NADPH氧化酶AtRBOHF途径来源的过氧化氢(H2O2)生成,随后导致硝酸还原酶Nial途径来源的一氧化氮(NO)富集,最终导致气孔关闭。但是,目前关于CDPKs在乙烯诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与H2O2和NO的相互关系尚不清楚。本论文以模式植物拟南芥野生型和CDPKs功能缺失突变体为实验材料,利用气孔开度测量和正置荧光显微镜技术,探究了参与乙烯诱导拟南芥气孔关闭的CDPKs,并阐明它们与H2O2和NO的上下游关系;借助酵母双杂交和双分子荧光互补技术初步探究了位于H2O2上游的CDPKs与H2O2形成酶AtRBOHD/F的互作。得到如下主要实验结果和相应结论:1.外源乙烯处理能够诱导拟南芥野生型气孔关闭,同时也可以导致cpk10、cpk23和cpk30突变体气孔关闭,但不能诱导cpk3、cpk4、cpk6、cpk11、cpk27和cpk33突变体叶片气孔关闭。说明 CDPK3、CDPK4、CDPK6、CDPK11、CDPK21和CDPK33均作为正调控因子参与了乙烯诱导拟南芥气孔关闭的信号转导途径。2.外源H2O2处理能诱导cpk3、cpk4、cpk11和cpk33突变体气孔关闭,也能部分或完全逆转这些突变体在外源乙烯处理下的气孔不关闭表型;但外源H2O2处理不能诱导cpk6和cpk21突变体气孔关闭,也不能逆转这两种突变体在乙烯处理下的气孔不关闭性。内源H2O2检测表明,外源乙烯处理能够诱导拟南芥野生型、cpk6和cpk21保卫细胞内源H2O2的生成,但不能诱导cpk3、cpk4、cpk11和cpk33突变体保卫细胞H2O2的生成。以上结果说明在乙烯诱导拟南芥气孔关闭的信号途径中,CDPK3、CDPK4、CDPK11 和 CDPK33 作用于 H2O2 的上游,CDPK6 和 CDPK21作用于H2O2的下游。3.外源NO供体硝普纳(SNP)处理能诱导野生型以及cpk3、cpk4、cpk11和cpk33突变体的气孔关闭,也能逆转这些突变体在乙烯处理下的气孔不关闭性;但外源SNP处理不能诱导cpk6和cpk21突变体的气孔关闭,也不能逆转这两种突变体在乙烯处理下的气孔不关闭性。内源NO检测表明,外源乙烯处理能够诱导野生型以及cpk6和cpk21突变体保卫细胞NO的生成,但不能诱导cpk3、cpk4、cpk11和cpk33突变体保卫细胞NO的生成。以上结果说明在乙烯诱导拟南芥气孔关闭的信号途径中,CDPK3、CDPK4、CDPK11和CDPK33作用于NO的上游,而CDPK6和CDPK21作用于NO的下游。4.酵母双杂交和双分子荧光互补实验结果表明CDPK3/4/11能与AtRBOHF相互作用,CDPK4/11也能与AtRBOHD相互作用,但CDPK33不能与AtRBOHD/F相互作用,暗示CDPK3/4/11介导乙烯诱导保卫细胞H2O2形成可能通过这些激酶与AtRBOHD/F的物理互作而磷酸化并活化这两种NADPH氧化酶。
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