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目的:蛭龙活血通瘀胶囊预处理局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠后,予以自噬诱导剂雷帕霉素及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(简称3-MA),与单独使用自噬诱导剂雷帕霉素及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤比较,观察不同缺血再灌注时间点大鼠神经功能评分、缺血区自噬水平、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Bcl-1表达及再灌注24小时后脑梗死体积百分比的变化,探讨自噬诱导剂及抑制剂在脑缺血再灌注损伤中的作用及蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤中自噬的双向调节作用。方法:1.分组方法:将200只SPF级健康雄性SD大鼠(所有实验大鼠的体重在均在280克到350克之间,周龄均在6周到8周之间)随机分为a、b、c、d四个组—a组为空白对照组(Blank,简称空白组);b组为脑缺血再灌注损伤模型组(MCAO,简称模型组);c组为蛭龙活血通瘀胶囊组,该组分为蛭龙+雷帕霉素+MCAO组(简称龙雷组)及蛭龙+3-MA+MCAO(简称龙甲组);d组为对照组,该组大鼠分为雷帕霉素+MCAO组(简称雷帕组)及3-MA+MCA0组(简称3-MA组)。2.给药方式:龙雷组及龙甲组大鼠在造模手术前首先予以蛭龙活血通瘀胶囊灌胃两周,而模型组、雷帕组、3-MA组则给予与龙雷组、龙甲组相同体积的蒸馏水灌胃两周,然后龙雷组、雷帕组大鼠于造模前1小时侧脑室注射雷帕霉素,龙甲组、3-MA于造模后12小时侧脑室注射3-MA。3.检测指标:1)各组大鼠在再灌注后0小时、2小时、6小时、12小时及24小时进行神经功能评分。2)在再灌注24小时取新鲜脑组织进行TTC染色,观察脑缺血24小时后梗死面积,推算脑梗死体积比。3)各组大鼠在各观察时间点灌注固定取标本电镜观察自噬体的变化情况。4)在各时间点取新鲜脑组织用免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Bcl-1的表达情况。结果:1.采用Garcia JH评分法对各组大鼠进行神经功能评分。与空白组比较,模型组、龙雷组、龙甲组、雷帕组及3-MA组大鼠的神经功能评分分数在再灌注后各观察时间点均明显降低,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,龙雷组、雷帕组、龙甲组大鼠在各个观察时间点的神经功能评分分数均增高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05);3-MA组实验大鼠在再灌注0小时、2小时、6小时的神经功能评分分数与模型组无明显差异,无统计学意义(P>0.05);但其神经功能评分分数在再灌注12及24小时增高,差异具有统计学意义(P<0.05);龙雷组与雷帕组比较,龙雷组实验大鼠的神经功能评分分数在实验各观察时间点明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);龙甲组与3-MA组相比较,在各观察时间点龙甲组实验大鼠的神经功能评分明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.TTC染色法推算脑梗死体积比:与空白组比较,大鼠脑梗死体积比在模型组、龙雷组、龙甲组、雷帕组及3-MA组均增大,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,大鼠脑梗死体积比在龙雷组、龙甲组、雷帕组及3-MA组均减小,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。龙雷组与雷帕组比较,大鼠脑梗死体积比明显减小,差异具有统计学意义(P<0.05)。龙甲组与3-MA组比较,实验大鼠的脑梗死体积比减小,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.电镜观察自噬体变化情况。在空白组中,神经元细胞内可见正常形态的细胞核、线粒体、丰富的内质网以及少数溶酶体结构;在模型组中,神经元细胞中可见空泡,线粒体明显肿胀,并可见到自噬体,且随着时间的延长自噬体数量逐渐增加,约在再灌注12小时时自噬体数目达到顶峰。龙雷组在缺血再灌注6小时时自噬体数目增加即达顶峰;而雷帕组在缺血再灌注6小时、12小时时从自噬体来看其数目相近,说明雷帕组变化的顶峰应在再灌注6小时与12小时之间;龙雷组与雷帕组相比较,在再灌注各时间点自噬体明显增多,降解的更快,说明蛭龙活血通淤胶囊与自噬诱导剂合用可以增强自噬水平。龙甲组与3-MA组相比较,在再灌注0小时、2小时、6小时龙甲组自噬体及溶酶体的表达增加;在再灌注12小时、24小时时龙甲组的自噬体及溶酶体较3-MA组减少,说明蛭龙活血通淤胶囊与自噬抑制剂合用可以抑制自噬过程。4.免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Bcl-1的表达。与空白组比较,模型组、龙雷组、雷帕组、龙甲组及3-MA组的LC3-Ⅱ、Bcl-1蛋白在每个时间点的表达水平都明显增强,差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,龙雷组及雷帕组大鼠的LC3-Ⅱ、Bcl-1蛋白表达水在各观察时间点均明显增强,差异均有显著统计学意义(P<0.01);龙甲组的LC3-Ⅱ、Bcl-1蛋白表达水平在再灌注0小时、2小时、6小时略有增强,差异具有统计学意义(P<0.05),在再灌注12小时、24小时减弱,差异具有统计学意义(P<0.05);3-MA组的的LC3-Ⅱ、Bcl-1蛋白表达水平在再灌注0小时、2小时、6小时与模型组无明显差别,无统计学意义(P>0.05),而在再灌注12小时及24小时其表达水平则减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。龙雷组与雷帕组比较,在每个时间点龙雷组的LC3-Ⅱ、Bcl-1蛋白的表达水平较雷帕组都明显增强,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。龙甲组与3-MA组比较,在再灌注0小时、2小时、6小时龙甲组的LC3-Ⅱ、Bcl-1蛋白表达水平较3-MA组都增强,差异具有统计学意义(P<0.05),在再灌注12小时、24小时龙甲组的LC3-Ⅱ、Bcl-1蛋白表达水平较3-MA组减弱,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论:1、通过对脑缺血再灌注损伤过程中自噬小体及自噬相关蛋白的检测,说明在脑缺血再灌注损伤中存在异常自噬。2、在脑缺血再灌注损伤早期使用自噬诱导剂可增强自噬水平,而在晚期使用自噬抑制剂则可抑制自噬水平。3、蛭龙活血通瘀胶囊可进一步改善缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,减少脑梗死体积比;在脑缺血再灌注损伤早期在自噬诱导剂的基础上进一步上调自噬相关蛋白Beclin-1,LC3-Ⅱ的表达,在晚期在自噬抑制剂的基础上则进一步抑制其表达。4、其机制可能为蛭龙活血通瘀胶囊对脑缺血在灌注损伤中的自噬具有双向调节作用,可增强自噬诱导剂及抑制剂的作用有关。