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目的乳腺癌是全世界女性中最常被诊断出的癌症,且多数被确诊后的患者会继续出现创伤后应激障碍的症状,并且症状通常会持续至少一年,其中疼痛,疲劳和绝经后症状为最常见,这些症状的识别和治疗是临床面临的主要问题,因为这些症状会损害患者健康及其相关的生活质量,且可以在任何年龄发作,但通常最常见于中年女性。由于早期诊断和治疗的进步,过去几年中乳腺癌的死亡率呈下降趋势,目前针对不同亚型乳腺癌的内分泌治疗中,所使用的药物被用于治疗和预防雌激素受体阳性乳腺癌。有研究表明,内分泌疗法是治疗乳腺癌的最有效且毒性小的疗法,内分泌治疗药物利用率的提高带来了预防和治愈乳腺癌程序的改进,但这也带来了新的挑战,其面临的主要有晚期复发,耐药性,注射痛苦和缺乏依从性等挑战。因此,寻找一种更为天然、有效、安全并能改善内分泌疗法不足之处的治疗药物,将为乳腺癌的治疗提供帮助。近年来,中药在抗癌治疗中有着日益广泛的应用,丹参作为我国的传统中药,其活性有效成分丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA已被证明具有明显的抗乳腺癌细胞增殖的作用,这与其植物雌激素样作用密切相关,而二氢丹参酮Ⅰ作为丹参的另一重要活性成分,也被证明具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,但其具体分子作用机制尚不明了。植物雌激素是植物产生的非甾体化合物,具有与内源性雌激素相似的化学结构,因此,可以通过激活或阻断雌激素与雌激素受体的结合,产生雌激素样和抗雌激素样作用。而雌激素受体是一类可以与雌激素特异性结合形成激素-受体复合物而发挥生物学效应的蛋白质,除经典核受体ERα和ERβ外,近年来研究者们从雌激素的靶细胞中又发现了一种新型的雌激素结合蛋白:G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER),其被证明与雌激素结合后,可激发细胞的非基因组信号传导途径,作用于下游细胞增殖和凋亡信号传导通路的相关信号分子,进一步调节细胞的增殖、分化、凋亡等行为。具体而言,在GPER介导的下游分子通路中,PI3K/AKT信号途径在细胞增殖、凋亡过程中起着重要的作用。有研究表明,PI3K/AKT过度激活状态和肿瘤的发生发展有着密不可分的关系,其可以通过调节细胞周期、细胞凋亡相关调控蛋白的活性介导乳腺癌细胞增殖效应,因此,GPER/PI3K/AKT信号传导通路已成为乳腺癌研究过程中的热点通路。本研究将选取常见的人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,观察二氢丹参酮Ⅰ对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响,并应用GPER及其下游传导通路关键因子干预剂,探讨GPER及其介导的PI3K/AKT信号通路在二氢丹参酮Ⅰ抗人乳腺癌MCF-7细胞中的作用,以期为全面揭示丹参的抗肿瘤效应及其机制提供参考。方法1.采用MTT细胞增殖实验观察二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞增殖率的影响;2.采用流式细胞术检测二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞增殖周期的影向;3.采用Annexin V-FITC/PI双染法检测二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡率的影响,并应用干预剂检测其对二氢丹参酮Ⅰ影响人乳腺癌MCF-7细胞凋亡率的干预作用;4.采用Western Blot技术检测二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞增殖周期相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白以及GPER/PI3K/AKT信号通路关键蛋白因子表达的影响,并加入干预剂:GPER特异性激动剂G1、P13K特异性抑制剂LY294002,观察它们对二氢丹参酮Ⅰ影响MCF-7细胞增殖和凋亡相关蛋白因子表达的干预作用,并揭示GPER及下游PI3K/AKT信号传导通路在二氢丹参酮Ⅰ抗乳腺癌效应中的介导功能。结果1.二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响1.1二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞增殖率的影响MTT检测结果显示,0.1～0.5μg/ml二氢丹参酮Ⅰ作用48h后,均可显著抑制MCF-7细胞的增殖(P<0.01)。1.2二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞增殖周期的影响流式细胞术结果显示,二氢丹参酮Ⅰ作用48h后,0.1μg/ml二氢丹参酮Ⅰ能够将MCF-7细胞阻滞在G1期。Western Blot检测结果显示,0.1μg/ml二氢丹参酮Ⅰ作用MCF-7细胞48h后,细胞周期相关蛋白cylinE、cyclinD1、CDK2蛋白的表达量都有一定程度的下降(P<0.01或0.05),而cylinA2蛋白的表达量基本无改变。2.二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响2.1二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡率的影响Annexin V-FITC/PI双染结果显示,二氢丹参酮Ⅰ可显著提高MCF-7细胞凋亡率(P<0.01)。2.2二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞中凋亡相关蛋白表达的影响Western Blot检测结果显示,0.1μg/ml二氢丹参酮Ⅰ在作用MCF-7细胞48h后,细胞凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bax表达量显著增加(P<0.05),而bcl-2表达量显著下降(P<0.05)。3.GPER在二氢丹参酮Ⅰ抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导其凋亡效应中的介导作用3.1 G1对二氢丹参酮Ⅰ影响MCF-7细胞凋亡率的干预作用Annexin V-FITC/PI双染结果显示,与二氢丹参酮Ⅰ组相比,G1干预可见MCF-7细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。3.2二氢丹参酮Ⅰ及干预剂G1对细胞中GPER表达量的影响在加入0.1μg/ml二氢丹参酮Ⅰ后,GPER蛋白表达量显著降低(P<0.01),而在此基础上加入GPER特异性激动剂GI干预后,与二氢丹参酮Ⅰ组相比,GPER蛋白表达量显著增加(P<0.01)。3.3 G1对二氢丹参酮Ⅰ影响MCF-7细胞增殖及凋亡相关蛋白表达的干预作用Western Blot检测结果显示,在加入GPER特异性激动剂G1干预后,与二氢丹参酮Ⅰ组相比,增殖相关蛋白cyinD1、cyclinE、CDK2表达量增加,凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、BAX表达量减少,bcl-2表达量增加(P<0.01或0.05)。4.基于PI3K/AKT信号通路探讨二氢丹参酮Ⅰ抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导其凋亡的分子机制4.1 LY294002对二氢丹参酮Ⅰ影响MCF-7细胞凋亡率的干预作用Annexin V-FITC/PI双染结果显示,与二氢丹参酮Ⅰ组相比,PI3K抑制剂LY294002干预可见MCF-7细胞凋亡率进一步增加(P<0.01)。4.2二氢丹参酮Ⅰ对MCF-7细胞PI3K、AKT表达的影响Western Blot检测结果显示,在加入二氢丹参酮Ⅰ作用后,与对照组相比,PI3K、AKT蛋白表达量降低(P<0.01或0.05),而在此基础上,加入1μg/mlGPER特异性激动剂G1干预后,与二氢丹参酮Ⅰ组相比,PI3K、AKT蛋白表达量增加(P<0.01)。4.3 LY294002对二氢丹参酮Ⅰ影响MCF-7细胞增殖及凋亡相关蛋白表达的干预作用Western Blot检测结果显示,在加入1μg/mlPI3K抑制剂LY294002后,与二氢丹参酮Ⅰ组相比,MCF-7中周期相关蛋白cyclinD1、cyclinE表达量显著降低(P<0.05),凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、BAX表达量显著增加(P<0.05),bcl-2表达量显著降低(P<0.05)。结论1.二氢丹参酮Ⅰ能够有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,并将其细胞周期阻滞在G1期,延缓了细胞周期的进程;2.二氢丹参酮Ⅰ能够提高MCF-7细胞凋亡率,并能够促进MCF-7细胞中对凋亡进程有正向作用的caspase-3、caspase-9、Bax蛋白表达,而抑制MCF-7细胞中对凋亡进程有负向作用的蛋白bcl-2的表达量;3.GPER介导了二氢丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应;4.抑制PI3K/AKT信号通路的传导是二氢丹参酮Ⅰ抗人乳腺癌MCF-7细胞的可能分子机制。