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龋病是发生在牙体硬组织的慢性细菌性疾病,多呈不可逆、渐进性进展趋势。根据发病部位不同,龋病可分为根面龋(root caries, RC)和冠龋(root caries, RC)两种类型。虽然同属龈上菌斑性疾病,但与冠龋相比,根面龋发病更隐蔽、不易修复且危害较大。截至2012年底,中国60周岁以上的老年人口已达1.94亿,2020年将达到2.43亿,2025年将突破3亿。随着人口老龄化日益加剧,根面龋发病率不断上升,将严重影响中老年人生命、生活质量。因此,根面龋的病因学研究、风险因素评估以及预防都是当今龋病学研究的重点和热点。目前公认的龋病病因学说是四联因素学说,主要包括细菌(bacteria)、饮食(substrate)、宿主(host)和时间(time),其中细菌微生物因素至关重要。然而口腔菌群是人体内最为复杂的微生物群落之一,一直以来人们对口腔微生物群落了解的深度和广度十分有限,并且针对根面龋的研究数目较少,研究方法落后,目前根面龋相关微生物病因仍然存在争议。本研究采用新一代高通量454GS FLX Titanium测序技术和实时定量PCR (quantitative real time PCR, qPCR)技术,分三部分研究老年人根面龋菌斑和唾液微生物群落构成,探索根面龋微生物细菌学病因。第一部分老年人根面龋患者和健康人牙菌斑微生物群落的宏基因组学研究实验一根面龋患者和健康人菌斑微生物细菌谱系分析与比较[目的]根面龋发病率高、危害大且细菌学病因仍存争议。本研究通过对比分析根面龋和健康人牙菌斑微生物群落细菌谱系,为寻找根面龋细菌学病因提供依据。[方法]分别收集根面龋患者根面龋龋坏牙菌斑(疾病组)、无龋牙菌斑(疾病对照组)和健康人无龋牙菌斑(健康对照组)样品,提取细菌基因组DNA,扩增16S rRNA V3-V5片段,采用454焦磷酸高通量测序,经HOMD数据库确定种属信息,比较分析三组牙菌斑微生物细菌谱系及构成。[结果]健康对照组的Alpha多样性(chaol丰度指数和shannon多样性指数)高于疾病组,但无统计学意义(p>0.05)。Beta多样性(未加权UniFrac和加权UniFrac)结果显示健康人之间的群落结构更为保守,根面龋人群更为分散、变异更大(p<0.05)。主成分分析(PCoA)显示根面龋疾病组和健康对照组呈分离趋势,疾病对照组位于两者之间更倾向于健康人群。通过门、属、种不同等级水平的定性、定量结果比较,展示了三组菌斑微生物细菌群落组成,并发现了一系列可能与根面龋相关的“风险因子”以及和健康相关的“保护性因子”。发现了不同疾病状态下龈上菌斑菌群存在核心微生物。[结论]本研究结果提示健康人牙菌斑细菌群落结构较根面龋患者更为保守；发现产酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidifaciens),变形链球菌(Streptococcus mutans), Olsenella profusa, Prevotella multisaccharivorax和卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)与根面龋密切相关,而代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans), Bacteroidetes[G-2] sp., Lachnospiraceae[G-3] sp.和中间普氏菌(Prevotella intermedia)与健康相关联；口腔龈上菌斑细菌群落存在核心微生物,其中7种细菌与根面龋密切相关而在健康菌斑中很少或没有表达,被认为是潜在致龋核心微生物。实验二根面龋患者和健康人菌斑细菌总量的检测及454测序方法学的验证[目的]定量检测并比较三组菌斑样品细菌总量和三种常见细菌(变形链球菌、双歧杆菌属、乳杆菌属)DNA水平。比较实时定量PCR和454结果以验证454测序方法的可靠性和可重复性。[方法]分别收集根面龋患者根面龋龋坏牙菌斑(疾病组)、无龋牙菌斑(疾病对照组)和健康人无龋牙菌斑(健康对照组)样品,提取细菌基因组DNA,采用实时定量PCR技术检测三组细菌总量和三种目标细菌DNA水平,比较分析qPCR结果和454结果。[结果]疾病对照组的细菌总量DNA水平最高,显著高于根面龋疾病组(p<0.05)。健康对照组细菌总量高于疾病组,低于疾病对照组,但差异无统计学意义(p>0.05)。对比发现三种目标细菌qPCR结果和454测序结果基本相似,两种独立检测方法得到的定量结果较为一致。[结论]健康状态(健康对照组、疾病对照组)菌斑细菌总量DNA水平高于疾病状(根面龋疾病组)态菌斑细菌总量。454焦磷酸测序技术手段可靠稳定,结果具有可重复性。第二部分根面龋和冠龋菌斑微生物群落的细菌学分析[目的]龋病可分为根面龋和冠龋两种类型。目前的观点认为根面龋的细菌菌群组成和冠龋不同,本研究通过对比分析根面龋和冠龋菌斑微生物生物群落组成,以验证根面龋和冠龋微生物群落是否相同,并为寻找龋病细菌学病因提供依据。[方法]分别收集根面龋龋坏牙菌斑(根面龋组)、冠龋龋坏牙菌斑(冠龋组)、龋坏患者健康牙菌斑(疾病对照组)和健康人无龋牙菌斑(健康对照组)样品,提取细菌基因组DNA,扩增16S rRNA V3-V5片段,采用454焦磷酸高通量测序,经HOMD数据库确定种属信息,比较分析四组菌斑微生物细菌谱系及构成。[结果]根面龋组的Alpha多样性(species物种指数、chaol丰度指数和shannon和simpson多样性指数)高于冠龋组,但无统计学差异(p>0.05)。未加权UniFrac Beta多样性显示健康对照组样品之间的群落结构更为保守,显著低于其他三组(p<0.05)；加权UniFrac Beta多样性显示根面龋组样品之间相距较最远、最为分散,显著高于冠龋组和健康对照组(p<0.05)。主成分分析(PCoA)显示根面龋组和冠龋组分布类似呈聚集趋势,与健康对照组呈分离趋势。通过在不同等级水平的定性、定量结果以及共有和特有OTU走势曲线,展示了根面龋和冠龋菌斑菌群组成相似,并且存在共同核心微生物。通过对比冠龋组和健康对照组菌群组成发现了多种龋相关细菌和健康相关细菌。[结论]本研究结果提示冠龋牙菌斑和健康无龋牙菌斑群落结构较根面龋患者更为保守；通过对比根面龋和冠龋菌斑微生物组成的定性、定量信息,主成分分析结果以及共有OTU和特有OTU走势曲线,发现根面龋和冠龋细菌群落构成和核心微生物都较为相似,提示参与根面龋和冠龋致龋微生物可能相同或相似。另外对比冠龋组和健康对照组微生物菌群组成,发现产酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidifaciens),变形链球菌(Streptococcus mutans), Olsenella profusa,唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)和Oribacterium sp.与龋病相关联,而Bacteroidetes [G-2], Fusobacterium sp., Capnocytophaga leadbetteri,中间普氏菌(Prevotella intermedia)以及Prevotella sp.和健康相关。第三部分老年人根面龋患者和健康人唾液相关致龋菌的研究[目的]根面龋在中老年人群中发病率高、危害大,常发生在暴露根面部位,长期浸泡在唾液之中,受唾液影响较大。本实验定量检测唾液中五种常见致龋菌DNA水平并评价与根面龋的关系。[方法]分别收集根面龋患者唾液(根面龋组)和健康人唾液(健康对照组)共43个样品,提取细菌基因组DNA,采用实时定量PCR检测五种细菌(变形链球菌、茸毛链球菌、双歧杆菌属、乳杆菌属、内氏放线菌)唾液DNA水平,分析与根面龋龋坏指数(根面龋补牙面数和根面龋指数)的关系。[结果]定性结果显示根面龋组的茸毛链球菌发病率显著高于健康对照组(p<0.05),根面龋组变形链球菌、茸毛链球菌、双歧杆菌任意双阳性检出率显著高于健康对照组(p<0.05)。定量结果显示比变形链球菌、茸毛链球菌、双歧杆菌属、乳杆菌属在根面龋患者唾液中DNA水平显著高于健康对照组(p<0.05)。相关性分析结果显示变形链球菌、茸毛链球菌、双歧杆菌属和根面龋补牙面数以及根面龋指数显著正相关(p<0.05)。[结论]双阳性检出率敏感性高于单阳性敏感率,可能更适合作为根面龋风险评估指标。变形链球菌、茸毛链球菌和双歧杆菌属定量结果显示和根面龋龋坏程度密切相关,可考虑作为根面龋风险评估生物指标。