目的：观察防龋基因疫苗pcDNA3/pacA和pcDNA3/pacP经肌肉注射、颌下腺区皮下注射和鼻腔粘膜滴注免疫日本长耳大白兔后的免疫效果，并探索免疫的最佳途径。 方法：本研究包括两部分：实验一：重组质粒pcDNA3/pacA、pcDNA3/pacP及空载体质粒pcDNA3的鉴定和大量制备。1.先小量抽提储存的重组质粒pcDNA3/pacA、pcDNA3/pacP及空载体质粒pcDNA3。2.限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pcDNA3/pacA、pcDNA3/pacP及空载体质粒pcDNA3是否正确。3.在鉴定正确的基础上，大量抽提重组质粒pcDNA3/pacA，pcDNA3/pacP及空载体质粒pcDNA3，紫外分光光度计测定所抽提质粒的OD值，并计算其浓度和纯度，贮存以备免疫动物。实验二：基因疫苗pcDNA3/pacA和pcDNA3/pacP免疫同本长耳大白兔。1.动物选择与分组：A大组：24只1.5kg日本长耳大白兔，随机分为9组，分别为：①pcDNA3股四头肌注射组(阴性对照组1)；②pcDNA3颌下腺区皮下注射组(阴性对照组2)：③pcDNA3鼻腔粘膜滴注组(阴性对照组3)；④pcDNA3/pacA股四头肌注射组；⑤pcDNA3/pacA颌下腺区皮下注射组；⑥pcDNA3/pacA鼻腔粘膜滴注组；⑦pcDNA3/pacP股四头肌注射组；⑧pcDNA3/pacP颌下腺区皮下注射组；⑨pcDNA3/pacP鼻腔粘膜滴注组。①～③组每组2只，④～⑨组每组3只。B大组：22只1.5kg 日本长耳大白兔，随机分为8组，分别为：①pcDNA3股四头肌注射组(阴性对照组)；②生理盐水股四头肌注射组(空白对照组)；③pcDNA3/pacA股四头肌注射组；④pcDNA3/pacA颌下腺区皮下注射组；⑤pcDNA3/pacA鼻腔粘膜滴注组；⑥pcDNA3/pacP股四头肌注射组；⑦pcDNA3/pacP颌下腺区皮下注射组；⑧pcDNA3/pacP鼻腔粘膜滴注组。①、②两组每组2只，③～⑧组每组3只。每只兔子的质粒DNA用量均为200μg(100μg/100μl)。2.免疫时间：共免疫3次，首次免疫后间隔2周以同样剂量加强免疫1次，再间隔1周加强免疫第2次。3.样品采集时间：分别于首次免疫前1天和免疫后第2、3、4、6、8、10、12、16周采集B大组动物的血液、唾液样品。4.特异性抗体的检测：血液中IgG抗体和唾液中S-IgA抗体采用酶联免疫吸附实验(间接ELISA法)检测。5.第3次免疫后第3天处死A大组动物，取注射部位股四头肌、颌下腺和鼻腔粘膜标本，常规固定、包埋，5μm连续切片，采用免疫组织化学SP法染色，所用一抗为兔抗PAc多克隆抗体。 结果：①在重组质粒小量抽提、鉴定无误的基础上，应用特大型质粒纯化试剂盒抽提出高纯度、高浓度的质粒。②经酶联免疫吸附实验证明，免疫后唾液S-IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高，并持续数周。且鼻腔滴注组比肌肉、颌下腺区皮下注射组诱导唾液IgA型特异性抗体要早。③在pcDNA3/pacA、pcDNA3/pacP肌肉注射组的股四头肌、颌下腺周注射组的颌下腺及鼻腔滴注组的鼻腔粘膜均检测到了表达的目的蛋白。 结论：①基因疫苗pcDNA3/pacA和pcDNA3/pacP具有免疫原性，能诱导日本长耳大白兔唾液和血液中特异性抗体的产生；②pcDNA3/pacA、pcDNA3/pacP在动物体内能够正确表达。⑨鼻腔粘膜免疫是简便有效的免疫途径。