【摘 要】
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背景:角膜缘上皮干细胞（limbal epithelial stem/progenitor cells,LESCs）是位于角膜缘基底层的成体干细胞,对维持角膜的透明性、损伤修复及完整性至关重要。角膜缘微环境细胞（limbal niche cells,LNCs）具有极强的支持LESCs干性的能力。据报道,共有四种分离扩增LNCs的方法。本研究对比了这四种分离方法,并比较了不同分离方法获得的LNCs对
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背景:角膜缘上皮干细胞（limbal epithelial stem/progenitor cells,LESCs）是位于角膜缘基底层的成体干细胞,对维持角膜的透明性、损伤修复及完整性至关重要。角膜缘微环境细胞（limbal niche cells,LNCs）具有极强的支持LESCs干性的能力。据报道,共有四种分离扩增LNCs的方法。本研究对比了这四种分离方法,并比较了不同分离方法获得的LNCs对LESCs干性的支持作用。方法:角膜缘组织块经单纯胶原酶（collagenase）消化后获得的LNCs记为C-LNCs,经中性蛋白酶（dispase）消化后再用胶原酶消化所获得的LNCs记为DC-LNCs,将中性蛋白酶消化后撕取的角膜缘上皮进行培养所获得的LNCs记为D-LNCs,通过组织块法培养的LNCs记为Ex-LNCs。采用RT-q PCR及免疫荧光检测四种细胞的间充质干细胞标记物的表达情况。通过克隆形成试验、三维（3D）共培养以及Transwell共培养对比四种LNCs支持LESCs的干性及促进其增殖的能力,并采用RT-q PCR分析Tranwell共培养系统中LESCs的Notch信号。结果:在四种LNCs的分离纯化过程中,DC-LNCs表达较低的角膜特异性标记物CK12。四种P4代LNCs中,DC-LNCs表达干细胞标记物Sox2、Oct4、Nanog、N-cadherin明显高于C-LNCs、D-LNCs和Ex-LNCs。与其他三种LNCs相比,DC-LNCs所支持的LESCs克隆形成效率更高。3D共培养结果证明,与DC-LNCs共培养的LESCs表达上皮干细胞标记物ΔNp63α最多。Transwell共培养结果证明,与DC-LNCs共培养的LESCs表达ΔNp63α和增殖标记物Ki67最多,并且DC-LNCs下调LESCs的Notch信号能力最强。结论:DC-LNCs的间充质干性以及对LESCs干性的支持作用最强。本实验为角膜上皮组织工程奠定了新的基础。
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