研究背景在我国,急性脑梗死是最常见的卒中类型,占所有脑卒中的69.6%～70.8%。有研究报告,我国急性脑梗死住院患者发病后1个月内病死率约为2.3%～3.2%,3个月的病死率和致残疾率分别为9%～9.6%和34.5%～37.1%,1年的病死率和致残疾率分别为14.4%～15.4%和33.4%～33.8%。高发病率、高致残率和高死亡率的特点使得急性脑梗死成为全球重点关注的公共卫生问题,加剧了社会和家庭的负担。目前,西医治疗急性脑梗死的最新指南推荐使用溶栓、抗凝、抗血小板聚集、降颅内压、降纤、支架置入等疗法。近年来,随着医药科技在中医药制剂领域的广泛运用,中药注射剂,尤其是具有活血化瘀功效的,开始运用于治疗脑梗死并取得较好的疗效。然而,活血化瘀类中药注射剂种类繁多,各有优劣,但临床开展的研究多是中药注射剂与西医治疗的疗效比较,故不同活血化瘀中药注射剂孰优孰劣尚不明确,致使临床医生在选择用药时由于缺乏证据而难以做出选择。因此,比较不同活血化瘀中药注射剂治疗急性脑梗死的效果很有必要。研究目的评价不同活血化瘀中药注射剂治疗急性脑梗死的疗效并将这些药物进行排序,从中选取疗效排序较好的两种药物初步探索两者治疗脑梗死的疗效机制差异。研究内容(1)开展网状Meta分析研究,即2019年版《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》(以下简称2019年版《国家医保目录》)中16种活血化瘀类中药注射剂治疗急性脑梗死的网状Meta分析。(2)开展排序前5位的中药注射治疗脑梗死的机理研究,即根据网状Meta分析结果,选择在神经功能缺损评分总有效率和NIHSS评分(National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)排序两个结局指标上均位于前5位的两种中药注射剂,基于网络药理学研究方法,初步探索上述两种中药注射剂治疗脑梗死的疗效机制差异。研究方法(1)网状Meta分析研究方法首先,全面检索中国期刊全文数据库(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)、维普数据库(VIP)、万方数据库(WanFang)、中国生物医学文献服务系统(SinoMed)、PubMed、Embase、Cochrane Library 和 Web of Science,检索香丹注射剂、丹参注射剂、丹红注射剂、脉络宁注射剂、红花注射剂、苦碟子注射剂、注射用丹参多酚酸盐、血塞通注射剂/注射用血塞通(冻干)、血栓通注射剂/注射用血栓通(冻干)、灯盏细辛注射剂、灯盏花素注射剂/注射用灯盏花素、冠心宁注射剂、疏血通注射剂、舒血宁注射剂、黄芪注射剂和瓜蒌皮注射剂共计16种活血化瘀类中药注射剂治疗急性脑梗死的随机对照试验。其次,采用Cochrane手册推荐的偏倚风险(Risk of Bias,ROB)评估工具对纳入研究进行质量评价。最后,基于频率学派的统计模型,采用STATA 16软件进行所有数据分析。具体内容包括:使用STATA 16软件中基于多元回归模型的mvMeta软件包进行网状Meta分析;采用Loop-specific Method来评估直接比较结果和间接比较结果的一致程度;计算累积排序概率图下面积(Surface Under the Cumulative Ranking,SUCRA),并以数值由大到小预测各治疗措施疗效排序。(2)网络药理学研究方法首先,通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)和中医百科全书(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM)收集已筛选出的丹红注射剂(丹参、红花)和脉络宁注射剂(石斛、牛膝、金银花、玄参)的活性成分和靶点,通过人类表型本体(Human Phenotype Ontology,HPO)数据库、Disease connect 数据库、Genecard 数据库和人类孟德尔遗传学(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)数据库收集脑梗死相关基因,数据背景设为人类基因(Homo Sapiens)。其次,使用Excel 2010整理上述收集的和筛选的结果,删除重复的靶点。将数据导入STRING工具构建以下网络:①丹红注射剂与脑梗死重叠靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络(Protein Protein Interaction,PPI);②脉络宁注射剂与脑梗死重叠靶点的PPI。网络的节点(Node)表示靶点,边(Edge)表示靶点和靶点之间的相互作用。利用Cytoscape软件中Network Analyzer工具计算网络的重要拓扑参数节点度(Degree)和中介中心度(Betweenness centrality)筛选丹红注射剂和脉络宁注射剂与脑梗死重叠的核心靶点。最后,利用DAVID数据库分别对丹红注射剂与脑梗死重叠的靶点和脉络宁注射剂与脑梗死重叠的靶点进行基因本体(Gene_Ontology,GO)功能和京都基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)生物学通路富集分析,以了解丹红注射剂和脉络宁注射剂治疗脑梗死涉及的生物过程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)、细胞组分(Cellular Components,CC)和 KEGG信号通路。即将上述筛选的靶点导入DAVID数据库,限定物种为人,选择标识为Official-gene-symbol,设定阈值P<0.05,筛选出具有统计学意义的生物学过程和信号通路。研究结果(1)网状Meta分析结果将初步检索出21348条相关记录导入文献管理软件NoteExpress,经查重后最终筛选出120篇中文文献。纳入研究的方法学质量总体偏低,主要体现在随机序列的生成、分配隐藏和盲法等条目。冠心宁注射剂、瓜蒌皮注射剂和黄芪注射剂的相关研究均不符合纳排标准。除常规治疗外,13种中药注射剂针对神经功能缺损评分总有效率指标的疗效排序由高到低依次为:脉络宁注射剂+常规治疗>灯盏细辛注射剂+常规治疗>丹红注射剂+常规治疗>注射用丹参多酚酸+常规治疗>血栓通注射剂+常规治疗>苦碟子注射剂+常规治疗>香丹注射剂+常规治疗>血塞通注射剂+常规治疗>疏血通注射剂+常规治疗>灯盏花素注射剂+常规治疗>舒血宁注射剂+常规治疗>红花注射剂+常规治疗>丹参注射剂+常规治疗;13种中药注射剂针对NIHSS评分指标的疗效排序由高到低依次为:血栓通注射剂+常规治疗>脉络宁注射剂+常规治疗>疏血通注射剂+常规治疗>苦碟子注射剂+常规治疗>丹红注射剂+常规治疗>舒血宁注射剂+常规治疗>灯盏花素注射剂+常规治疗>注射用丹参多酚酸+常规治疗>灯盏细辛注射剂+常规治疗>血塞通注射剂+常规治疗>红花注射剂+常规治疗>香丹注射剂+常规治疗>丹参注射剂+常规治疗。(2)网络药理学研究结果鉴于疗效排序均位于前5位的注射剂有脉络宁注射剂、丹红注射剂和血栓通注射剂,而血栓通注射剂与血塞通注射剂有效化学成分相同,不便于区分。因此,本研究选取脉络宁注射剂和丹红注射剂开展机制研究。通过检索TCMSP平台和ETCM平台获得丹红注射剂活性成分339个,基因靶点2479个。通过TCMSP平台和ETCM平台获得脉络宁注射剂活性成分204个,基因靶点1660个。通过检索HPO数据库、Disease-connect数据库、OMIM数据库和Genecard数据库获得脑梗死基因650个。丹红注射剂与脑梗死重叠的靶点基因有13个,脉络宁注射剂与脑梗死重叠的靶点基因有38个。丹红注射剂与脑梗死重叠靶点的相互作用网络包括12个节点,21条边;脉络宁注射剂与脑梗死重叠靶点的相互作用网络包括34个节点,125条边。两种中药注射剂均可通过肿瘤抑制蛋白(Tumor Protein p53,TP53)、内皮一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase 3,NOS3)等核心靶点,纤维蛋白溶解、一氧化氮生物合成过程、一氧化氮介导的信号转导、内皮细胞细胞凋亡负调节、凋亡过程的负调控等生物过程,磷脂酰肌醇3’-激酶(The phosphatidylinositol 3’-kinase-Akt,PI3K-Akt)信号通路、缺氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor-1,HIF-1)信号通路和细胞凋亡等信号通路发挥治疗脑梗死的作用。丹红注射剂还可通过纤溶酶原激活物抑制因子1(Serpin Family E Member 1,SERPINE1)、白细胞介素-4(Interleukin-4,IL4)、淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)等核心靶点,应力激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)级联、活性氧代谢过程的正调控、死亡结构域受体对外源性凋亡信号通路的负性调控等生物过程,MAPK信号传导途径等通路治疗脑梗死。脉络宁注射剂还可以通过激酶插入结构域受体(Kinase Insert Domain Receptor,KDR)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL10)、Toll-样受体 4(Toll-like Receptor 4,TLR4)等核心靶点,炎症反应、缺氧的细胞反应和白细胞介素-10产生的正调控等生物过程,血小板活化和血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信号传导等信号通路发挥治疗脑梗死的作用。结论(1)网状Meta分析结果表明丹红注射剂和脉络宁注射剂治疗急性脑梗死在改善神经功能缺损评分总有效率和NIHSS评分两个结局指标上比其他活血化瘀中药注射剂效果好。(2)网络药理学研究结果表明脉络宁注射剂核心靶点拓扑分析结果整体情况优于丹红注射剂。丹红注射剂的活性成分侧重从调控凝血过程、能量代谢调节和保护血脑屏障等途径来治疗脑梗死,重在活血。脉络宁注射剂的活性成分侧重从调控血小板活化、血栓形成、炎症反应和通过对血管的功能进行调控以抑制动脉粥样硬化损伤等途径治疗脑梗死,重在活血兼清热。(3)药理学研究结果在一定程度上解释了临床疗效的差异。中医药疗效评价应坚持倡导以疗效为先导的研究策略,可以在临床疗效比较评价确切之后,基于优势评价指标,有针对性地开展机制研究,以更好地为临床上针对同一疾病的同类竞争药物的选择提供用药参考和依据。