研究背景：　　 原发性肝癌(primary carcinoma of the liver)是世界最常见且恶性程度最高的肿瘤之一，近年来发病率有逐渐增加的趋势。全世界平均每年有100万人死于肝癌。发病率在恶性肿瘤中位居世界第5位，死亡率位居第3位。原发性肝癌更是我国常见的恶性肿瘤，病例数约占世界肝癌总数的43.7％，男女比例约为3：1，死亡率在男性仅次于胃癌，占恶性肿瘤死因的第2位，在女性仅次于胃癌和食管癌，占恶性肿瘤死因的第3位。全世界每年新发病例约62万人，我国占55％。由于肝癌的病因及发病机制不是很明确，故目前临床上还缺乏针对此病的特异性治疗。其治疗手段多采用外科手术、化疗、放疗、介入及中医药等综合治疗。　　 肿瘤是一种受多因素影响的多阶段发生发展过程，癌基因的激活与抑癌基因的失活与异常被认为是其中重要的事件。多数研究表明，PTEN(phosphatase and tesin homolog deleted on chromosometen，第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因)蛋白的表达低下或缺失和PI3K(phosphoinositide 3 kinase，磷脂酰肌醇3-激酶)信号通道的激活与原发性肝癌的发生发展、转移、预后等相关，因而成为近几年设计抗癌新药的重要靶点与热点。但是，有关复方中药对PTEN蛋白、PI3K信号通道在肝癌进展中的变化规律及调节作用目前国内外未见报道。因此，探讨不同治法的复方中药对PTEN蛋白表达和PI3K信号通道的调控作用，将有利于进一步认识中药的抗癌机制。　　 古代中医学文献并无肝癌病名的记载，而类似肝癌的症状和体征(如痛在肋下、黄疸、痞块等)记载十分丰富，多属于中医学“臌胀”、“积聚”、“癥瘕”、“黄疸”、“暴症”等范畴。中医病因学认为肝癌多系外感时邪、酒食不节、情志郁怒、正气亏虚所致。其病性常虚实夹杂，虚以脾气虚等为主；实则以气滞血瘀、湿热淤毒为患。毒、虚、瘀、热是肝癌的基本病变，贯穿肝癌发病的全过程。在治疗上，以健脾益气贯穿始终；调理气机为先；清热解毒适当用之为治疗原则。因此健脾益气、清热解毒中药是治疗肝癌的首选的、必需的药物。临床实际表明，中医药在提高肝癌病人的生活质量、延长生存时间有独特的优势。故此，有必要对临床上常用的治疗肝癌的复方中药的抗癌机制进行深入研究，使人们对中药抗癌作用及机制的认识现代化、科学化。　　 导师陈泽雄教授依据对肝癌“正虚邪实”、“本虚标实”这一中医学发病机制的根本认识，认为邪正关系始终是肝癌发生和发展的关键，故“扶正祛邪”是治疗肝癌的根本大法。　　 益气健脾汤和清热解毒汤是导师对肝癌中医临床治疗经验的总结，具有益气健脾助运、清热解毒、疏肝散结的功效。两方可明显改善肝癌患者的临床症状，提高肝癌患者的生活质量，但其作用机制目前不是很明确。因此，有必要在动物模型中进一步探讨本方的抗癌作用及机制。　　 本研究共分两部分，第一部分为益气健脾汤和清热解毒汤的急性毒性实验，第二部分为益气健脾汤和清热解毒汤对肝癌裸鼠PTEN、PI3K表达的影响。　　 研究目的：　　 1.观察益气健脾汤、清热解毒汤是否对小鼠起到毒性作用。　　 2.观察益气健脾汤、清热解毒汤对间接原位移植雄性裸鼠肝癌模型的生存状况。　　 3.观察裸鼠肝癌组织PTEN蛋白、PI3K蛋白表达情况，进一步揭示益气健脾汤、清热解毒汤的抗癌机制。　　 第一部分健脾解毒复方中药的急性毒性试验　　 材料：　　 1.药物与试剂：清热解毒汤(半枝莲6份、半边莲3份、土鳖虫2份等)与益气健脾汤(党参6份、半枝莲6份、莪术3份等)用中药配方颗粒(三九医药股份有限公司提供)配制。用蒸馏水溶解以上中药颗粒配制药液，配制标准为5.00g生药/ml(相当于200倍于人单位公斤体重剂量)。　　 2.实验动物：健康昆明小鼠30只，体重20±2g，雌雄各半，由中山大学动物实验中心提供(动物合格证号0052548)。　　 实验方法：　　 通过测定动物的最大耐受量评估药物的安全性。将健康昆明小鼠30只，体重20±2g，雌雄各半，随机分成三组，分别灌服200倍于人用口服剂量的中药清热解毒汤、益气健脾汤和蒸馏水(0.4ml/次*只)，每天灌胃两次，连续给药7天，给药结束后再观察7天。实验期间对动物体重变化等反应性指标进行观察记录。　　 结果：　　 三组小鼠于实验后体重均增长(清热解毒汤组、益气健脾汤组、蒸馏水组平均增加的体重分别为13.07±2.26g/只、14.32±3.08g/只、15.01±3.01g/只)，其变化差别均有统计学意义(P＜0.001)，但任何两组间小鼠体重变化无统计学意义(P＞0.01)，各组小鼠未见急性中毒表现。　　 结论：　　 清热解毒汤与益气健脾汤未见急性毒性作用，提示在临床常规用量情况下，两种中药组方是安全的。　　 第二部分健脾解毒复方中药对肝癌裸鼠PTEN、PI3K表达的影响　　 材料：　　 1.造模材料：人肝细胞癌细胞株Bel-7402；接种人肝细胞癌细胞株Bel-7402的荷瘤雄性BALB/c裸鼠2只；4-5周龄的BALB/c裸鼠雄性180只(肝癌造模160只，空白对照20只)。　　 2.干预材料：益气健脾汤和清热解毒汤浓缩剂；FT-207注射液(替加氟注射液)。　　 3.试剂：兔抗人PTEN单克隆抗体，兔抗人PI3K多克隆抗体，二步法免疫组织化学检测试剂。　　 实验方法：　　 1.造模采用Bel-7402人肝癌细胞株复制裸鼠“间接肝原位移植瘤模型”。　　 2.干预裸鼠在无特殊病原菌(SPF)条件下分笼饲养。将造模裸鼠随机分为8组(生理盐水组，FT-207化疗组，益气健脾汤低、中、高浓度组，清热解毒汤低、中、高浓度组)，每组各20只，8组模型鼠术后随即进入实验。胃饲给药，生理盐水组用0.2ml/10g体重的生理盐水灌服；替加氟组用4倍人单位公斤体重剂量FT-207(替加氟)注射液(3.35mg生药/ml，0.2ml/10g体重)灌服；其余6组分别予以益气健脾汤和清热解毒汤10倍、20倍、40倍于人单位公斤体重剂量灌服(10倍于人单位公斤体重剂量为0.25g生药/ml，0.2ml/10g体重)，每天一次，连续6周。到第6周各组随机处死一半(10只)，另一半停止药物干预，进行正常喂养，直到第10周后再处死余下瘤鼠。另外设空白对照组20只。　　 3.处理观察过程中，记录瘤鼠的生存时间，生存状况。6周后各组随机处死一半(10只)，解剖处死的裸鼠，记录肿瘤体积，并将正常肝组织、癌旁组织和癌组织标本用4％中性甲醛溶液固定后进行病理石蜡包埋切片。直到第10周后再处死余下瘤鼠。观察目标及处理同前。　　 4.用常规苏木精一伊红染色做组织学检测(HE)；PTEN和PI3K蛋白采用二步法免疫组织化学检测方法检测；采用Bresalier半定量公式进行染色结果评估；采用双人双盲阅片方式阅片，共2次，分别计算表达强度(IS)，取2次的平均数作为评估结果。　　 5.统计学分析：计量正态资料用(-x)±s表示，非正态计量资料用“中位数(极值)”表示，计数资料用“部分/总体”。对计量资料进行T检验、方差分析、秩和检验，计数资料采用卡方检验、秩和检验。所有数据采用SPSS17.0统计软件处理。　　 结果：　　 1.解剖证实造模成功率159/160(生理盐水组有一只裸鼠因植瘤手术时麻醉过量死亡)；实验结束获得有效病理标本159例。成瘤以单发巨块型为主，部分伴肝内和/或肺内多发转移，符合人类肝癌解剖特点。　　 2.生存时间：采用生存分析法分析各组之间平均生存时间差异，P=0.981＞0.05，差别无统计学意义，但第10周中药清热解毒汤低浓度组的存活率有明显高于其它组的趋势。　　 3.体重变化：采用重复测量法分析第1周，第6周，第10周各组平均体重变化差异，P=0.078＞0.05，差别无统计学意义。　　 4.瘤体积：对第6周的各组平均瘤体积差异分析，采用与PTEN、PI3K表达有统计学意义的生理盐水组、替加氟化疗组、益气健脾汤低浓度组、清热解毒汤高浓度组，做组间对比，P=0.0865＞0.05，差别无统计学意义。　　 5.PTEN表达：第6周中药清热解毒高浓度组治疗该肝癌动物模型与替加氟/生理盐水对比，可以明显提高抑癌基因PTEN的表达，p=0.02/0.01＜0.05，差别有统计学意义。　　 6.PI3K表达：第6周PI3K在益气健脾低浓度组癌组织的表达强度与生理盐水组对比分析，P=0.04＜0.05，差别有统计学意义。　　 7.PTEN与PI3K相关性分析显示：第6周替加氟化疗组呈负性相关趋势，但并没有统计学意义，其余各组成正性相关，也没有统计学意义。　　 结论：　　 1.本研究所采用的肝癌动物模型是研究肝癌治疗较为理想的实验动物模型。　　 2.本实验中的益气健脾汤、清热解毒汤均能够上调荷瘤鼠癌组织PTEN蛋白的表达，显示以清热解毒汤高浓度组(1g生药/ml，0.2ml/10g体重)较佳。而益气健脾汤低浓度组(0.25g生药/ml，0.2ml/10g体重)对PI3K的下调有明显优势。本实验PTEN与PI3K之间无明显的正负相关。　　 3.本实验中的中药组、替加氟组、生理盐水组各组体重及生存时间差异无统计学意义，但清热解毒汤低浓度组的存活率有明显高于其它组的趋势；各组第六周肿瘤体积差异无统计学意义。