论文部分内容阅读
胃肠动力障碍是糖尿病主要并发症之一,细胞凋亡在糖尿病及其并发症的发生中起重要作用；磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)所组成的PI3K/Akt信号转导通路与糖尿病的葡萄糖代谢、细胞凋亡密切相关。本研究旨在探讨糖尿病结肠动力障碍与结肠平滑肌细胞(SMC)、Cajal间质细胞(ICC)凋亡的关系以及胰岛素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的干预效果和机制,以期为糖尿病结肠并发症的发生、治疗提供理论依据。第一部分糖尿病结肠动力障碍结肠SMC和ICC凋亡的研究目的：探讨糖尿病结肠动力障碍结肠SMC、ICC的凋亡情况及ICC的缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的变化。方法：雄性SD大鼠36只,随机分为正常6周、10周组,糖尿病6周、10周组,每组9只。链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,检测体质量、空腹血糖及胃肠推进率；HE染色观察结肠平滑肌变化；实时荧光定量PCR、Western Blot(?)检测结肠SMC的bax、bcl-2及caspase-3的mRNA和蛋白表达水平；TUNEL检测结肠SMC和ICC的凋亡指数(AI)；免疫组化检测ICC的Cx43蛋白表达。结果：(1)糖尿病组大鼠较同时间点正常组大鼠体质量下降,空腹血糖升高,胃肠推进率降低,结肠平滑肌变薄,SMC的bax及caspase-3的mRNA和蛋白表达增强,bcl-2的mRNA和蛋白表达降低,AI升高；ICC的c-Kit、Cx43蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)糖尿病10周组大鼠较糖尿病6周组大鼠空腹血糖升高,胃肠推进率降低,结肠平滑肌变薄,SMC的bax及caspase-3的mRNA和蛋白表达增强,bcl-2的mRNA和蛋白表达降低,AI升高；ICC的c-Kit、Cx43蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)糖尿病组大鼠较同时间点正常组大鼠结肠ICC的AI、糖尿病10周组大鼠较糖尿病6周组大鼠结肠ICC的AI差异无统计学意义(P>0.05)。结论：结肠SMC凋亡增加和ICC数量减少、Cx43蛋白表达降低可能是糖尿病结肠动力障碍发生机制之一,且上述改变随病程发展而加重；ICC数量减少可能与ICC凋亡无关。第二部分糖尿病结肠动力障碍结肠SMC凋亡途径的研究目的：探讨糖尿病结肠动力障碍结肠SMC凋亡的途径。方法：正常10周及糖尿病10周大鼠各9只,免疫组化检测结肠SMC的CASPASE-9、CASPASE-12和CASPASE-8蛋白表达。结果：糖尿病10周组大鼠结肠SMC较正常10周组CASPASE-9表达增强,差异有统计学意义(P<0.01),CASPASE-12和CASPASE-8表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论：糖尿病结肠动力障碍结肠SMC凋亡可能与线粒体通路所介导的凋亡相关,可能与内质网通路、死亡受体通路所介导的凋亡无关。第三部分胰岛素及IGF-1对糖尿病结肠动力障碍结肠SMC凋亡影响目的：探讨胰岛素及IGF-1对糖尿病结肠动力障碍结肠SMC凋亡的影响。方法：雄性SD大鼠117只,随机分为正常6周、10周组,糖尿病6周、10周组,IGF-1干预6周、10周组,胰岛素干预6周、10周组(分为大剂量、中剂量和小剂量胰岛素干预),共13组,每组9只。检测体质量、空腹血糖、胃肠推进率及血清胰岛素、血清IGF-1水平；HE染色观察结肠平滑肌变化：实时荧光定量PCR、Western Blot法检测结肠SMC的bax、bcl-2及caspase-3的mRNA和蛋白表达水平；TUNEL检测结肠SMC的AI。结果：(1)在6周组,胰岛素及IGF-1均可使结肠SMC的bax、caspase-3的mRNA和蛋白表达下调,bcl-2的mRNA和蛋白表达上调和AI降低,胃肠推进率升高,与糖尿病组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；其中大剂量胰岛素干预效果较中、小剂量胰岛素干预效果显著,差异均有统计学意义(P<0.05),中、小剂量胰岛素干预效果之间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)在10周组,胰岛素及IGF-1均可使结肠SMC的bax、caspase-3的mRNA和蛋白表达下调,bcl-2的mRNA和蛋白表达上调和AI降低,胃肠推进率升高,与糖尿病组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；其中早期大剂量胰岛素干预效果较中、小剂量胰岛素及晚期大剂量胰岛素干预效果显著,差异均有统计学意义(P<0.05),中、小剂量胰岛素与晚期大剂量胰岛素干预效果三者之间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)与糖尿病组比较,胰岛素干预组均血糖降低,血清胰岛素升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且血清胰岛素水平与SMC的AI呈负相关(r=-0.709,P<0.01)；IGF-1干预组血清IGF-1水平升高,差异有统计学意义(P<0.01),血清IGF-1水平与SMC凋亡呈负相关(r=-0.857,P<0.01),但未降低血糖。结论：胰岛素及IGF-1干预均可改善糖尿病结肠动力障碍结肠SMC凋亡,其中早期大剂量胰岛素干预效果较中、小剂量胰岛素及晚期大剂量胰岛素干预显著。第四部分高糖、胰岛素及IGF-1对结肠SMC的PI3K/Akt通路作用目的：探讨高糖、胰岛素和IGF-1对结肠SMC的增殖、凋亡及PI3K/Akt信号转导通路的影响。方法：体外组织贴块法培养大鼠结肠SMC,分为正常对照组、高糖组(33.3mmol/L葡萄糖)、高糖+LY10组(33.3mmol/L葡萄糖+10μmol/LLY294002)、甘露醇组(33.3 mmol/L甘露醇)、Ins组(100nmol/L胰岛素)、Ins+LY1O组(100 nmol/L胰岛素+10 (μmol/L LY294002)、Ins+LY50组(100nmol/L胰岛素+50μmol/L LY294002)、IGF-1组(100μg/LIGF-1)、IGF-1+LY10组(100μg/L IGF-1+10μmol/L LY294002), IGF-1+LY50组(100μg/L IGF-1+50μmol/LLY294002)。MTT比色法检测结肠SMC的增殖情况；流式细胞仪检测结肠SMC的凋亡情况；Western Blot法检测结肠SMC的Akt、p-AktThr308、p-AktSer473及CASPASE-9蛋白表达水平。结果：(1)大鼠结肠SMC培养成功。(2)与正常对照组比较,高糖组和高糖+LY10组均细胞增殖减弱,凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.01)；上述改变在高糖+LY10组进一步增加,与高糖组比较差异有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组比较,高糖组p-AktThr308表达减弱,差异有统计学意义(P<0.01); p-AktSer473和Akt表达差异均无统计学意义(P>0.05)。甘露醇组细胞增殖、凋亡率及p-AktThr308、p-AktSer473和Akt表达与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)与正常对照组比较,ins组细胞增殖增强,凋亡率降低,p-AktSer473表达增强,CASPASE-9表达减弱,差异均有统计学意义(P＜0.01)。Ins+LY10组和Ins+LY50组均细胞增殖减弱,凋亡率升高,p-AktSer473表达减弱,CASPASE-9表达增强,差异均有统计学意义(P<0.01)；上述改变在Ins+LY50组进一步增加,与Ins+LY10组比较差异有统计学意义(P<0.01)。p-AktThr308和Akt表达在正常对照组、Ins组、Ins+LY10组和Ins+LY50组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)与正常对照组比较,IGF-1组细胞增殖增强,凋亡率降低,p-AktSer473表达增强,CASPASE-9表达减弱,差异均有统计学意义(P<0.01)。IGF-1+LY10组和IGF-1+LY50组均细胞增殖减弱,凋亡率升高,p-AktSer473表达减弱,CASPASE-9表达增强,差异均有统计学意义(P<0.01)；上述改变在IGF-1+LY50组进一步增加,与IGF-1+LY10组比较差异有统计学意义(P<0.01)。p-AktThr308和Akt表达在正常对照组、IGF-1组、IGF-1+LY10组和IGF-1+LY50组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：高糖可能通过PI3K/Akt信号转导通路抑制SMC增殖,促进SMC凋亡,该作用与渗透压变化无关；胰岛素及IGF-1可能通过PI3K/Akt信号转导通路促进SMC增殖,抑制SMC凋亡。