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军团菌是引起军团病(Legionnaires disease,LD)和庞蒂亚克热(Pontiacfever)的主要病原菌,目前,世界多个国家和地区均有病例报道。军团菌(Legionella)为革兰氏阴性杆菌,引起人类疾病的主要是嗜肺军团菌,有15个血清型,它广泛存在于自然界,尤其是水体中,某些自由生活的阿米巴可摄入军团菌。军团菌主要引起肺炎,但常伴有肺外表现,故又称军团病。
近年来,随着人类的生活水平不断提高,大型公共设施、各种空调、排水管道、冷却塔、加湿器等大量应用,加大了军团菌污染的可能性。为了进一步控制这种发展趋势,建立有效、快速检测和鉴定军团菌的方法则显得尤为重要。
本文以引起人类军团菌病常见的嗜肺军团菌12种血清型(嗜肺军团菌血清型O1型、O2型、O3型、O4型、O5型、O6型、O7型、O10型、O11型、O12型、O13型和O15型)为研究对象,结合寡核苷酸芯片技术在基因水平上进行分子学检测方法的研究。我们分别利用16S rDNA设计引物探针作为正对照,以O抗原基因簇中的wzt,wzm和wecA基因作为靶基因筛选适合这12种血清型菌的特异分子标识,成功研制了嗜肺军团菌O血清型分型基因芯片。
通过对上述特异基因进行比对,我们设计了血清型特异性引物和探针,经过保守性和特异性的反复筛选验证,最终得到了特异性引物10对,特异探针25条。另外设计了背景检测探针1条,荧光探针1条,以16S rDNA设计正对照探针1条,共计28条。之后点制基因芯片、进行杂交液选择、杂交温度、杂交时间、PCR扩增标记等条件的优化,对芯片的特异性及灵敏度进行评价,同时进行模拟样品实验和实际样品实验对芯片的应用性能进行验证。
本文所建立的运用寡核苷酸芯片技术进行的致病菌的检测比传统方法检测时间短、灵敏度高、特异性高,并且可实现对多种血清型菌的同时检测,为今后在军团菌检测、鉴定领域开展进一步的研究和更大规模的使用奠定了可靠的理论与技术基础。