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龙眼(Dimocarpus Longan Lour)属无患子科(Sapindaceae )龙眼属,是我国南方诸省较重要而有特色的一种热带亚热带木本果树。由于龙眼合子胚遗传背景复杂,童期长,阻碍对其胚胎发育相关基因的研究。本文以龙眼子叶胚为材料,建立cDNA-AFLP技术体系,分析龙眼胚胎发育相关的基因差异表达,为研究龙眼胚胎发育奠定基础。建立了RACE体系,克隆了看家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH),并作为后续试验的内参;以这个RACE体系克隆了一系列与龙眼胚胎发育相关的基因,同时对这些基因在胚胎发育中的表达特性也进行了研究。1利用cDNA-AFLP技术分析龙眼子叶胚的发育分别以小量法和大量法提取‘红核子’龙眼谢花后35天子叶胚(早期子叶胚)和谢花后50天子叶胚(晚期子叶胚)的RNA,经过合成双链cDNA、酶切、加接头、预扩增和选择性扩增一系列步骤,建立适宜于龙眼子叶胚的cDNA-AFLP分析体系,得到了条带清晰、对应良好、信号强度基本一致、分布均匀的cDNA-AFLP指纹图谱,对41个差异片段回收克隆和序列分析,发现其中21个与已知功能基因具有高度同源性,这些基因的功能主要涉及侧生器官的离轴极性、糖酵解、能量代谢、离子转运、细胞壁伸长、细胞周期调控、RNA转录、RNA翻译和调控、蛋白磷酸化调控和降解、信号转导等;另外20个片段与已知基因的同源性较低或未发现同源性。随机挑选7个进行RACE扩增,RT-PCR检测其表达情况。2龙眼子叶胚GAPDH基因全长cDNA克隆及序列分析根据Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit特点,设计两端锚定引物,同时根据与已知的GAPDH基因高度同源的EST序列设计巢式引物,成功地扩增出该基因的3′端和5′端,说明这种RACE方法适合用于扩增龙眼子叶胚的基因。序列分析表明,该基因的cDNA全长为1395bp,包括一个长1008bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,其核苷酸和氨基酸序列与其他物种的GAPDH基因具有高度同源性。GAPDH基因是组成型表达,可以作为内参基因。3龙眼子叶胚离轴极性基因YABBY2的克隆和序列分析采用巢式的RACE方法,获得与拟南芥YABBY2同源的基因,共获得三个全长YAB2-1,YAB2-2,YAB2-3和三个片段YAB2-4,YAB2-5,YAB2-6。生物信息学分析表明这几个基因有不同的3′端非编码区和5′端非编码区,有高度一致的开放阅读框,在YAB2-1,YAB2-2,YAB2-3的5′端非编码区发现疑似的IRES序列。半定量RT-PCR分析表明YAB2-3在早期子叶胚显著地表达,在晚期子叶胚中微量表达;YAB2-1和YAB2-2在早期和晚期胚都显著表达,但早期表达量大;YAB2-4是微量表达的基因,在晚期胚胎表达量较大。4龙眼胚胎FVE、Remorin、CCR4-NOT等基因克隆和序列分析采用巢式的RACE方法,成功地扩增龙眼的FVE、Remorin、CCR4-NOT的全长序列,获得硫转运蛋白基因的5′端序列、脱水应答蛋白相关基因3′端序列和几丁质酶基因3′端序列。FVE基因具有WD40superfamily结构域,表达量极其显著,早期表达量较大;Remorin基因在早期胚中显著地表达,在晚期胚微弱地表达;CCR4-NOT基因在早期和晚期胚都显著表达,早期胚胎表达量较大;硫转运蛋白基因是微量表达的基因,在早期胚胎中表达量较大;几丁质酶基因也是微量表达的基因,在晚期胚胎表达量较大。脱水应答蛋白的相关基因在早期胚显著表达,但晚期胚微量表达。