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实验一:二苯乙烯苷(TSG)对绝经后大鼠骨质疏松性(PMOP)骨折影响及最佳有效浓度筛选的实验研究目的:探讨二苯乙烯苷(TSG)对绝经后大鼠骨质疏松性(PMOP)骨折术后骨折愈合的影响,并筛选最佳有效浓度。材料与方法:(1)选取三月龄SD雌性大鼠48只,按照随机数字表法随机分为6组,每组8只。分别是:假手术组(Sham)、模型组(OVX)、二苯乙烯苷高剂量组、二苯乙烯苷中剂量组、二苯乙烯苷高剂量组、雷洛昔芬组。采用去势法(去卵巢)复制绝经后骨质疏松大鼠模型,手术成功后饲养12周。(2)去势法成功复制绝经后骨质疏松大鼠模型后,所有大鼠均采用手术横断右侧股骨干,并进行手术复位和股骨髓腔内克氏针固定,复制骨质疏松性骨折术后模型。术后第3天开始灌胃给药,连续灌胃7周。(3)灌胃7周后,各组大鼠腹腔麻醉,腹主动脉采血,离心后取上清,使用ELISA法测定血清总I型胶原氨基端延长肽(PⅠNP),骨碱性磷酸酶(BALP),全自动生化分析仪分析血清钙、磷含量。双能X线测定左侧股骨骨密度,病理组织切片采用HE染色观察骨痂形态,万能材料测试仪测试骨痂相关生物力学指标,小动物CT观察骨折愈合情况。结果:1.去势法造模后,Sham组体重明显低于OVX组,差异具有统计学意义(P<0.05)。干预7周后,TSG的高、中、低剂量组与雷洛昔芬组的体重明显低于OVX组,差异具有统计学意义(P<0.05)。OVX组子宫质量比Sham组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。TSG中剂量组与雷洛昔芬组子宫质量比OVX组高,差异具有统计学意义(P<0.05)。OVX组子宫系数比Sham组小,差异具有统计学意义(P<0.05)。TSG中剂量与雷洛昔芬组子宫系数比OVX大,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.与Sham组相比,OVX组骨小梁明显稀疏,骨小梁数量较少,连续性差,骨小梁所占总面积小。骨痂处新生成骨细胞较少,未成熟的骨细胞及成骨细胞比例较大。与OVX组相比,TSG中剂量组骨小梁致密,骨小梁数目多,连续性好,骨小梁占总面积大,新生成骨细胞丰富,成熟的成骨细胞及骨细胞所占比例大,矿化程度也较OVX组好。与OVX组相比,TSG高、低剂量组与雷洛昔芬组骨小梁结构也有所改善,成骨细胞也比OVX组丰富,矿化程度也较好。3.OVX组血清钙与血清磷含量均低于Sham组,但差异无统计学意义(P>0.05)。与OVX组相比,各组血清钙、磷均略高,然而差异无统计学意义(P>0.05)。进行各组之间钙磷乘积的比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4.与Sham组相比,OVX组的血清PINP含量较低,差异有统计学意义(P<0.05)。与OVX组相比,TSG高、中剂量组与雷洛昔芬组PINP含量较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与OVX组相比,TSG低剂量组PINP含量高,但差异无统计学意义(P>0.05)。与Sham组相比,OVX组的血清BALP含量较低,差异有统计学意义(P<0.05)。与OVX组相比,TSG高、中剂量组与雷洛昔芬组BALP含量较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与OVX组相比,TSG低剂量组BALP含量高,但差异无统计学意义(P>0.05)。5.与Sham组相比,OVX组骨密度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与OVX组相比,TSG高、中剂量组与雷洛昔芬组的骨密度明显升高,差异具有统计学意义。与OVX组相比,TSG低剂量组骨密度较高,但差异无统计学意义(P>0.05)。6.与Sham组相比,OVX组弹性模量较低,但差异无统计学意义(P>0.05)。除TSG高剂量组外,其余各组弹性模量均高于OVX组,但差异无统计学意义(P>0.05)。与Sham组相比,OVX组的最大力,断裂力与抗弯强度均有明显呈度的下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与OVX组相比,除了TSG低剂量组外,其余各组最大力与抗弯强度均提高,差异有统计学意义(P<0.05)。其余各组断裂力比OVX组都较高,但是除了TSG中剂量组外,其余各组差异均无统计学意义(P>0.05)。7.与Sham组相比,OVX组骨痂稀疏,断裂严重,骨折线不连续,硬性骨痂比列较小,骨痂愈合较慢,矿化程度低。与OVX组相比,各组的骨痂均有明显的改善,特别是TSG中剂量组,骨折线连续,硬性骨痂较多,甚至多处已经开始进行骨痂塑形。结论:1.绝经后骨质疏松大鼠体重增加、子宫萎缩,TSG可以明显改善大鼠因绝经导致的体重增加与子宫萎缩。2.TSG干预可以促进大鼠骨折愈合与骨痂矿化,改善骨小梁结构。3.TSG干预对大鼠血清钙、磷影响较小。4.TSG干预可以改善大鼠血清PINP与BALP情况。5.TSG干预可以改善绝经后骨质疏松大鼠的骨密度。6.TSG干预可以改善大鼠骨组织的负荷与载荷,提高生物力学性能。7.TSG干预可以促进大鼠骨质疏松性骨折愈合,加速骨痂矿化,减少愈合时间。实验二:探讨通过调控Wnt/β-catenin信号通路,二苯乙烯苷(TSG)促进成骨细胞增殖的作用以及对其成骨分化能力的机制研究目的:1.探讨二苯乙烯苷(TSG)对成骨前体细胞MC3T3-E1成骨分化能力的作用及机制研究,为体内实验提供理论支持。2.研究二苯乙烯苷(TSG)促小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1增殖作用以及Wnt/β-catenin信号通路中相关信号分子的表达,并初步探讨相关机制。材料与方法:1.将成骨前体细胞MC3T3-E1在十二孔板内均匀接种,当细胞均匀铺满视野达90%时,更换成骨细胞诱导培养基继续培养。实验分组如下:(1)完全培养基组:完全培养基处理组。(2)空白对照组:成骨分化培养基处理组。(3)TSG组A:10-2mg/m LTSG+成骨分化培养基处理组(4)TSG组B:10-3mg/m LTSG+成骨分化培养基处理组(5)TSG组C:10-4mg/m LTSG+成骨分化培养基处理组。在诱导7d、14d、21d后,采用茜素红染色分析评价成骨前体细胞MC3T3-E1的矿化程度。采用ALP染色和ALP检测试剂盒定性与定量分析评价成骨细胞MC3T3-E1分化活性标志物ALP的分泌表达情况。2.使用小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1细胞系,在96孔板中加入浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5mg/m L的TSG培养基,分别在作用于24、48、72h后用CCK-8法测定细胞存活情况,评价药物毒性作用,选出最佳有效浓度。利用western blot技术,在蛋白水平评价β-catenin和cyclin-D1的表达水平,初步阐述TSG对成骨前体细胞MC3T3-E1增殖作用的相关机制。结果:1.在成骨诱导分化培养基干预7d后,各组均未形成细胞外基质钙离子复合物沉积。14d时,成骨前体细胞外基质逐渐出现钙离子复合物的沉积,钙结节反映了成骨细胞的矿化程度。与完全培养基组相比,添加成骨诱导分化培养基的各组均出现不同大小的钙离子结节。与空白对照组相比,各组添加TSG作用后,形成的钙结节沉积物面积较大,这种表现在21d时更为明显。2.在成骨诱导分化培养基干预7d后,成骨分化诱导剂各组ALP蓝色形成数量明显高于完全培养基组,并且清晰的看到TSG给药各组的ALP蓝色形成数量比未加TSG干预明显增多。在14d的时候,上述情况更为突出,TSG干预各组大量细胞胞浆内出现蓝色染色。3.与完全培养基组相比,空白对照组与不同浓度的TSG组的AKP活力明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比,TSG组A细胞内AKP的活力值明显高于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与之相反的是TSG组B、C的AKP活力值虽然高于空白对照组,但是有差异无统计学意义(P>0.05)。4.24h时,各组OD值差异无统计学意义(P>0.05),48h时,除了TSG为10-5mg/ml剂量组外,其余各组与空白对照组相比,OD值均增高,差异具有统计学意义。72h时,与空白对照组相比,除了10-5mg/ml组外,其余各组OD值均增高,差异具有统计学意义(P>0.05)。5.经过TSG处理后,蛋白β-catenin表达明显上升,明显高于未处理组,差异具有统计学意义(P<0.05)。但是不同浓度TSG干预后,各组之间虽有差异,但是并未具备统计学意义(P>0.05)。下游cyclin-D1蛋白作为影响成骨细胞分化的重要蛋白之一,出现了与核心蛋白β-catenin同样的结果,TSG处理组cyclin-D1蛋白表达水平明显高于未处理组,差异具有统计学意义(P<0.05)。但是TSG各组间差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论:1.TSG干预可以促进成骨前体细胞分化以及细胞外基质矿化,形成更大的钙结节沉积。2.TSG干预可以促使成骨前体细胞分化能力增强,在胞内产生大量的活性ALP/AKP。3.TSG干预可以促进成骨前体细胞增殖,无明显的细胞毒性作用。4.TSG可以通过促进Wnt/β-catenin信号通路核心蛋白β-catenin与下游cyclin-D1的蛋白表达来促进成骨细胞增殖与分化。