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胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率位居全球第2位。在中国，2015年胃癌的发病率为15.8％，死亡率为17.6％，在癌症发病顺位中排第二。早期胃癌患者预后较好，且根治性手术治疗疗效显著，其术后5年生存率在85-90％之间[2]，但胃癌早期检出率较低，中国胃癌患者中超过75％确诊时已进展至中晚期阶段。
目前临床上胃癌的治疗方法不多，单纯手术治疗患者的总体生存率仅19％左右，疗效不佳。此外，放、化疗虽为治疗恶性肿瘤的一个重要手段，但其副作用较大，多应用于术前或术后的辅助性治疗或姑息性治疗。早期侵袭转移是胃癌患者死亡的重要原因，同时肿瘤的侵袭转移机制十分复杂。这一过程主要包括细胞粘附分子(CAM)、细胞外基质(ECM)的变化、上皮间质转化和肿瘤血管生成等，并受多种多样的因素调控。研究表明，抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)是一种进化上高度保守的蛋白，在调节细胞能量代谢、增殖凋亡、核转录中发挥了重要功能。在多种恶性肿瘤中存在PHB的异常表达，有研究发现PHB与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。
南蛇藤(Celastrus Orbiculatus Thunb)系卫矛科南蛇藤属植物，又名过山风、黄藤等，其藤茎、根、叶、果实、种子均可入药，有祛风除湿、行气活血、消肿止痛、解毒等功效。南蛇藤乙酸乙酯提取物(Celastrus Orbiculatus ethylacetate extract，COE)抗肿瘤活性较强。近年体内、外相关实验研究发现，COE能够抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞调亡自噬、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力等，进而抑制多种肿瘤细胞的生长及转移。本课题组前期研究发现，COE能够明显抑制胃癌细胞的侵袭、转移和EMT的发生，并通过蛋白质组学技术筛选出其靶点蛋白，PHB为其4个差异蛋白点之一。因此，本研究通过RNAi技术获得人胃癌MGC-803/PHB-细胞株，同时观察PHB低表达及不同浓度的COE作用后肿瘤细胞侵袭迁移能力的改变，并探索其作用机制。结果表明，COE通过调控PHB来抑制胃癌细胞的侵袭转移，其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
本文主要从以下几方面进行论述：
（一）南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803细胞中PHB表达水平的影响
目的:研究不同浓度南蛇藤提取物(COE)对人胃癌MGC-803细胞中PHB表达水平表达水平的影响。
方法:对数期人胃癌MGC-803细胞，分别设置阴性对照组、不同浓度(10，20，40μg/mL) COE加药组、阳性对照组（5-fu32μg/mL、JLC0.4 mg/mL）。药物处理细胞24 h后，收集并提取细胞的总蛋白，通过蛋白质印迹法测定细胞中PHB蛋白的表达情况。
结果:COE作用MGC-803细胞24 h后，随药物浓度的增加，PHB表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:COE抑制人胃癌MGC-803细胞中PHB的表达水平。
（二）人胃癌MGC-803/PHB-细胞株的构建及PHB低表达对MGC-803细胞侵袭转移的影响
目的:构建PHB低表达人胃癌MGC-803细胞株，观察PHB低表达对MGC-803细胞侵袭转移的影响。
方法:体外培养人胃癌MGC-803细胞至对数期，利用RNAi技术，将LV-PHB-RNAi基因整合入MGC-803细胞DNA，使人胃癌细胞MGC-803中PHB低表达，同时设立野生型细胞组及阴性对照组。转染24h后，倒置荧光显微镜下观察感染后细胞的荧光强度，收集并提取细胞总蛋白，Western blot法检测细胞中PHB蛋白的表达。同时，Transwell细胞侵袭实验测定PHB低表达后，MGC-803细胞侵袭能力的改变。Transwell迁移实验和细胞划痕实验，检测PHB低表达对人胃癌MGC-803迁移能力的影响。同时，Western blot法检测PHB低表达后细胞中侵袭转移相关分子(包括E-cadherin、Vimentin、N-cadherin)，基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）及c-Raf/ERK信号通路相关蛋白的表达水平。
结果:慢病毒转染24 h后，倒置荧光显微镜下，人胃癌MGC-803细胞发出明显的绿色荧光。Western blot结果发现，对比于野生型细胞Control组及空质粒Vehicle组，转染LV-PHB-RNAi细胞组中PHB蛋白表达水平明显下降。PHB低表达能够降低人胃癌MGC-803细胞侵袭迁移能力。同时，PHB低表达后，间质标志物N-cadherin、Vimentin，基质金属蛋白(MMP2、MMP9)及c-Raf、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平降低，上皮标志物E-cadherin表达水平增加。
结论:成功构建人胃癌MGC-803/PHB细胞株。PHB低表达抑制人胃癌MGC-803细胞的侵袭迁移能力，其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
（三）南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803/PHB-细胞侵袭转移的影响
目的:探讨南蛇藤提取物COE对人胃癌MGC-803/PHB-细胞侵袭转移的影响。
方法:对数期人胃癌MGC-803/PHB-细胞，分为阴性对照组(MGC-803/PHB-细胞，不加药)，不同浓度COE组(10，10，20，40，160，320μg/mL)和阳性对照组（5-fu32μg/mL、JLC0.4 mg/mL）。MTT比色法观察药物作用后MGC-803/PHB-细胞增殖抑制的影响，并确定下一步COE药物实验浓度。Transwell细胞侵袭实验观察药物作用对细胞侵袭能力的改变。Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验，观察药物作用后细胞迁移能力的影响。药物作用24 h后，Western blot法检测不同浓度COE作用后，人胃癌MGC-803/PHB-细胞中EMT相关分子(包括E-cadherin、Vimentin、N-cadherin)，基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）及c-Raf/ERK信号通路相关蛋白（c-Raf、 ERK1/2、 p-ERK1/2）的表达变化。
结果:药物作用细胞24 h、48 h、72 h后，人胃癌MGC-803/PHB-细胞的生长受到不同程度的抑制，且具有一定的时间、剂量的依赖性。同时，确定COE非细胞毒性的浓度梯度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，进行后续实验。药物作用24 h后，与阴性对照组对比，人胃癌MGC-803/PHB-的侵袭迁移能力下降。同时，COE降低Vimentin、N-cadherin、MMP2、MMP9、c-Raf、 ERK1/2蛋白的表达水平，呈浓度依赖性;随着COE浓度的增加，E-cadherin、p-ERK1/2蛋白的表达水平上升。
结论:COE抑制人胃癌细胞MGC-803/PHB-细胞的增殖和侵袭迁移能力，其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
目前临床上胃癌的治疗方法不多，单纯手术治疗患者的总体生存率仅19％左右，疗效不佳。此外，放、化疗虽为治疗恶性肿瘤的一个重要手段，但其副作用较大，多应用于术前或术后的辅助性治疗或姑息性治疗。早期侵袭转移是胃癌患者死亡的重要原因，同时肿瘤的侵袭转移机制十分复杂。这一过程主要包括细胞粘附分子(CAM)、细胞外基质(ECM)的变化、上皮间质转化和肿瘤血管生成等，并受多种多样的因素调控。研究表明，抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)是一种进化上高度保守的蛋白，在调节细胞能量代谢、增殖凋亡、核转录中发挥了重要功能。在多种恶性肿瘤中存在PHB的异常表达，有研究发现PHB与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。
南蛇藤(Celastrus Orbiculatus Thunb)系卫矛科南蛇藤属植物，又名过山风、黄藤等，其藤茎、根、叶、果实、种子均可入药，有祛风除湿、行气活血、消肿止痛、解毒等功效。南蛇藤乙酸乙酯提取物(Celastrus Orbiculatus ethylacetate extract，COE)抗肿瘤活性较强。近年体内、外相关实验研究发现，COE能够抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞调亡自噬、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力等，进而抑制多种肿瘤细胞的生长及转移。本课题组前期研究发现，COE能够明显抑制胃癌细胞的侵袭、转移和EMT的发生，并通过蛋白质组学技术筛选出其靶点蛋白，PHB为其4个差异蛋白点之一。因此，本研究通过RNAi技术获得人胃癌MGC-803/PHB-细胞株，同时观察PHB低表达及不同浓度的COE作用后肿瘤细胞侵袭迁移能力的改变，并探索其作用机制。结果表明，COE通过调控PHB来抑制胃癌细胞的侵袭转移，其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
本文主要从以下几方面进行论述：
（一）南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803细胞中PHB表达水平的影响
目的:研究不同浓度南蛇藤提取物(COE)对人胃癌MGC-803细胞中PHB表达水平表达水平的影响。
方法:对数期人胃癌MGC-803细胞，分别设置阴性对照组、不同浓度(10，20，40μg/mL) COE加药组、阳性对照组（5-fu32μg/mL、JLC0.4 mg/mL）。药物处理细胞24 h后，收集并提取细胞的总蛋白，通过蛋白质印迹法测定细胞中PHB蛋白的表达情况。
结果:COE作用MGC-803细胞24 h后，随药物浓度的增加，PHB表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:COE抑制人胃癌MGC-803细胞中PHB的表达水平。
（二）人胃癌MGC-803/PHB-细胞株的构建及PHB低表达对MGC-803细胞侵袭转移的影响
目的:构建PHB低表达人胃癌MGC-803细胞株，观察PHB低表达对MGC-803细胞侵袭转移的影响。
方法:体外培养人胃癌MGC-803细胞至对数期，利用RNAi技术，将LV-PHB-RNAi基因整合入MGC-803细胞DNA，使人胃癌细胞MGC-803中PHB低表达，同时设立野生型细胞组及阴性对照组。转染24h后，倒置荧光显微镜下观察感染后细胞的荧光强度，收集并提取细胞总蛋白，Western blot法检测细胞中PHB蛋白的表达。同时，Transwell细胞侵袭实验测定PHB低表达后，MGC-803细胞侵袭能力的改变。Transwell迁移实验和细胞划痕实验，检测PHB低表达对人胃癌MGC-803迁移能力的影响。同时，Western blot法检测PHB低表达后细胞中侵袭转移相关分子(包括E-cadherin、Vimentin、N-cadherin)，基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）及c-Raf/ERK信号通路相关蛋白的表达水平。
结果:慢病毒转染24 h后，倒置荧光显微镜下，人胃癌MGC-803细胞发出明显的绿色荧光。Western blot结果发现，对比于野生型细胞Control组及空质粒Vehicle组，转染LV-PHB-RNAi细胞组中PHB蛋白表达水平明显下降。PHB低表达能够降低人胃癌MGC-803细胞侵袭迁移能力。同时，PHB低表达后，间质标志物N-cadherin、Vimentin，基质金属蛋白(MMP2、MMP9)及c-Raf、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平降低，上皮标志物E-cadherin表达水平增加。
结论:成功构建人胃癌MGC-803/PHB细胞株。PHB低表达抑制人胃癌MGC-803细胞的侵袭迁移能力，其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
（三）南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803/PHB-细胞侵袭转移的影响
目的:探讨南蛇藤提取物COE对人胃癌MGC-803/PHB-细胞侵袭转移的影响。
方法:对数期人胃癌MGC-803/PHB-细胞，分为阴性对照组(MGC-803/PHB-细胞，不加药)，不同浓度COE组(10，10，20，40，160，320μg/mL)和阳性对照组（5-fu32μg/mL、JLC0.4 mg/mL）。MTT比色法观察药物作用后MGC-803/PHB-细胞增殖抑制的影响，并确定下一步COE药物实验浓度。Transwell细胞侵袭实验观察药物作用对细胞侵袭能力的改变。Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验，观察药物作用后细胞迁移能力的影响。药物作用24 h后，Western blot法检测不同浓度COE作用后，人胃癌MGC-803/PHB-细胞中EMT相关分子(包括E-cadherin、Vimentin、N-cadherin)，基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）及c-Raf/ERK信号通路相关蛋白（c-Raf、 ERK1/2、 p-ERK1/2）的表达变化。
结果:药物作用细胞24 h、48 h、72 h后，人胃癌MGC-803/PHB-细胞的生长受到不同程度的抑制，且具有一定的时间、剂量的依赖性。同时，确定COE非细胞毒性的浓度梯度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，进行后续实验。药物作用24 h后，与阴性对照组对比，人胃癌MGC-803/PHB-的侵袭迁移能力下降。同时，COE降低Vimentin、N-cadherin、MMP2、MMP9、c-Raf、 ERK1/2蛋白的表达水平，呈浓度依赖性;随着COE浓度的增加，E-cadherin、p-ERK1/2蛋白的表达水平上升。
结论:COE抑制人胃癌细胞MGC-803/PHB-细胞的增殖和侵袭迁移能力，其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。