【摘 要】
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该研究的目的就是克隆抗伪狂犬病病毒抗体重链、轻链可变区基因,构建单链抗体基 因,利用噬菌体展示技术制备噬菌体抗体,并在大肠杆菌中进行可溶性表达,获得具有对伪狂犬病病
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该研究的目的就是克隆抗伪狂犬病病毒抗体重链、轻链可变区基因,构建单链抗体基 因,利用噬菌体展示技术制备噬菌体抗体,并在大肠杆菌中进行可溶性表达,获得具有对伪狂犬病病毒结合活性的表达产物,为以后在治疗、预防上的应用奠定基础.将伪狂犬病病毒(北京分离株)利用蔗糖密度梯度离心纯化,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细 胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法三次克隆,获得了2株能稳定分泌抗伪狂犬病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株1H7和3B5.从分泌具有中和活性的单克隆抗体杂交瘤细胞1H7中用异 硫氰酸胍裂解法提取mRNA,以此为模板反转录为cDNA第一链,采用RT-PCR以小鼠抗体重链可变区VH和轻链可变区VL特异性引物扩增VH、VL基因片段,经重叠引物延伸PCR(SOE-PCR)把VH与VL用编码(Gly<,4>Ser)<,3>连接肽序列的Linker连接成单链抗体ScFv基因,克隆入噬菌粒pCANTAB5E载体并转化E.coliTC1感受态细胞,在SOBAG上筛选转化子,并用M13KO7超感染, 获得了抗伪狂犬病病毒噬菌体单链抗体文库.用阳性重组噬菌体感染不含琥珀抑制基因E.coli菌株HB2151,经IPTG诱导,获得了可溶性表达的抗PrV单链抗体.表达产物经ELISA鉴定表明其具有与PrV结合活性.SDS-PAGE检测,在约30Kda处有一条新生带生成,与预期大小相符.
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