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植物细菌性青枯病(Ralstoniasolanacearum)是一种世界性的重要土传病害,该病菌寄主范围广泛,可以侵染近50个科的几百种植物。烟草青枯病是烟草上危害最严重的病害之一,一直威胁着烟草业的生产,目前尚无有效的防治措施,选育抗病品种是防治青枯病的有效方法。然而,随着烟草品种的更换、地理区域和环境的变化,病菌的菌系产生分化,其遗传组成发生变异。
本论文从广东省韶关和梅州两大烟草产区,采集了来自8个县市的共38个烟草(NicotianatabaVUIllL)青枯菌菌株,并对病菌的生物型、致病型、生长温度和遗传多样性进行了研究。同时对来源于16个科的26种寄主上的68个青枯菌菌株进行了生物型研究和RAPD分析。结果如下:
1、根据对6种碳水化合物利用能力的差异,将来源于20多种作物上的青枯菌分为5种生物型,每种生物型内还分为不同的亚型,其中广东烟草青枯菌全部属于生物型IⅡ,香蕉青枯菌属于一个新的生物型。
2、广东烟草青枯菌生长的最高温度为40℃,最低温度为14℃,最适生长温度为30~34℃,但梅州地区和韶关地区部分菌株的生长温度仍表现差异。
3、通过测定烟草青枯病菌在红花大金元,K326,岩烟97和系3四个烟草鉴别品种上的致病性反应,将广东烟草青枯菌分为强致病力,中等致病力和弱致病力三种致病型,其中以中等致病力菌株为主,占73.5%;强致病力菌株占17.6%:弱致病力菌株占8.8%。
4、在对青枯菌进行DNA水平上的遗传多样性分析时,用改进了的CTAB/SDS法提取供试青枯菌的DNA,优化了PCR反应各个参数,最终建立了适用于青枯菌RAPD的最佳反应体系,即:25,uL体系中,含有0.3μL5U//tLTaqDNA聚合酶,2.0μL25mmol/L的MgCl2,2.0μL2.5mmol/LdNTPs,1.0μL20μmol/L随机引物,2.5μL10×PCRbuffer,1.0μLDNA模板,15.7μL双蒸灭菌水。反应程序为:94℃预变性5min;94~C变性lmin,37℃退火lmin,72℃延伸2min,40循环;72℃延伸10min,4℃保存。
5、从¨6个RAPD通用引物中筛选出19条引物,用于对68个青枯菌株的DNA进行PCR扩增,共扩增出694条带,其中664条为多态性条带,多态性比率为95.7%,扩增片段多在0.3~3.5kb之间。其中,引物OPAl0、OPB07、OPE01、OPFl0、OPK08、OPRl6的扩增多态性较高,达到100%。
6、对PCR产物电泳,DNA指纹特征分析,并用Ntsys软件聚类。结果表明,来源于-16个科、26种寄主上的68个青枯菌可分为9个簇群。其中烟草青枯菌聚在I、V簇群中,第Ⅱ簇群包含有茄子(SolanummelongenaL、花生(ArachishypogaeaD、番茄(LycopersiconesculentumMill)、辣椒(CapsicumfrutescemsL)、木棉(BombaxmaliabaricumDc)、苎麻(BoehmerianiveaD、芝麻(Lamiumbarbatum)、木麻黄(CasuarinaequisetifoD、油橄榄(CanariumalbumRaeusch.)、桑树(MorusalbaD、桉树(EucalyptuscongoRobl)、生姜(ZingiberofficinaleRoso)等青枯菌株;第1II簇群包含有西番莲(PassifloraedulisSims)、爪哇白豆蔻(AmomumkravanhPirre)、排草(LysimachiacapillipesHemsl.)、金光菊(RudbeckialaciniataL)、菊花(Dendranthemamorifolium)、生姜、姜花(HedychiumcoronariumKoenig)、甘薯(lpomoeabatatasLam)、马铃薯(SolanumtuberosumL)青枯菌株;第Ⅵ簇群为1个香蕉(Musaspp.)青枯菌株;第Ⅶ簇群为1个美人蕉(CannaindicaLinn)青枯菌株;第Ⅷ簇群包含黄穗(SolidagoCanadensisL)和百日草(Zinniaelegans)青枯菌株;Ⅳ、Ⅸ簇群分别为1个马铃薯青枯菌株。RAPD分析结果与菌株的寄主来源有一定相关性,但不与生化型和致病型相关。
7、单独对38个烟草青枯菌菌株的DNARAPD聚类分析结果表明:广东烟草青枯菌菌株可以聚为A、B两大类,其中A类又可以分为7个群,各个群与菌株来源的寄主品种有一定的相关性,如A2群包含所有供试的来自烟草品种9032的菌株和来自云烟87品种的菌株,A3、A4群则以来自品种K326为主,B类可分为4个群,每个群都以来自品种K326的菌株为主。