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目的:磁性纳米四氧化三铁(magnetic Fe3O4 nanoparticles,Fe3O4-MNPs)是一种性能稳定、无毒、磁性强、生物相容性较好而且制备相对简单的磁性材料,体内外及临床实验均提示Fe3O4-MNPs对机体无明显毒性,有较好的生物相容性。本课题旨在研究Fe3O4-MNPs的制备和表征及比较不同浓度的Fe3O4-MNPs溶液对正常小鼠免疫器官和功能的影响,为Fe3O4-MNPs作为药物载体临床应用提供理论依据。
方法:(1)使用化学共沉淀法制备Fe3O4-MNPs。(2)使用透射电镜、扫描电镜、电位粒径仪、X射线衍射仪、能量分散X射线光谱仪及振动试样磁力计检测和分析Fe3O4-MNPs的表征。(3)将10％Fe3O4-MNPs一次性喂食40只小鼠,14天后处死小鼠收集标本。(4)采用甲基四唑蓝法(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT)法检测刀豆球蛋白(canavalin,ConA)诱导下小鼠脾淋巴细胞增殖情况,了解不同浓度Fe3O4-MNPs对免疫细胞增殖的作用。(5)使用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠外周血中辅助T细胞(T helper cell,Th)分泌相关的细胞因子白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、IL-4、IL-10和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平,了解Fe3O4-MNPs对小鼠机体内细胞因子分泌水平的影响。(6)通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群CD3+CD4+,CD3+CD8+细胞比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+细胞比值,分析Fe3O4-MNPs对小鼠T细胞亚群分化的影响。(7)取喂食14天后小鼠的皮肤、肝脏、脾脏、大肠,观察其组织病理学改变。
结果:(1)化学共沉淀法制备出黑色颗粒状晶体,加去离子水后呈棕红色悬浮液。(2)透射电镜观察发现Fe3O4-MNPs外形呈现大小不等的近似球形:扫描电镜观察发现Fe3O4-MNPs外形呈现大小不等的不规则状;电位粒径仪检测发现Fe3O4-MNPs平均粒径是44.0nm,平均电位是-24.71mV;X射线衍射仪检测显示Fe3O4-MNPs的衍射峰分别是(111),(220),(311),(400),(422),(511),(440)和(533);能量分散X射线光谱仪检测显示Fe3O4-MNPs元素主要由Fe及O原子组成;振动试样磁力计检测Fe3O4-MNPs室温下的饱和磁化强度是47.33emu/g,样品展示出很好的超顺磁性。(3)Fe3O4-MNPs一次性喂食14天后小鼠无死亡,成功收集小鼠的皮肤、肝脏、脾脏、大肠标本。(4)ICR小鼠脾淋巴细胞增值指数在实验组及对照组之间没有显著性差异(p＞0.05)。(5)ELISA检测结果显示,各剂量组IL-2、IL-10和IFN-γ、IL-4的水平与对照组相比无显著性差异(p＞0.05)。(6)流式检测T淋巴细胞亚群时,低剂量组与对照组相比无显著性差异,而中高剂量组与对照组相比CD3+CD4+,CD3+CD8+细胞比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+细胞比值均有显著提高(p＜0.05)。(7)光学显微镜观察显示:小鼠皮肤结构完整,被覆鳞状上皮完整,角化层无增厚,真皮内无血管扩张充血、炎细胞浸润,毛囊、皮脂腺结构完整;肝细胞排列呈索状,1例肝细胞见轻度细胞水肿(+),肝窦无明显扩张,肝小叶结构完整,汇管区无炎细胞浸润及纤维结缔组织增生;脾脏包膜无增厚,脾小体清晰可见,脾小体体积轻度缩小(+),脾窦无扩张,脾小梁未见增粗;大肠各层结构清晰,粘膜上皮完整,粘膜下层固有腺体无萎缩、增生或化生,间质结缔组织血管无扩张充血,无明显的炎细胞浸润,肌层结构完好,浆膜无炎性渗出物。提示不同剂量Fe3O4-MNPs喂食的ICR小鼠皮肤、肝脏、大肠及脾脏均无明显差异。
结论:(1)通过表征测定证实我们用化学共沉淀法成功地制备出平均粒径为15nm的Fe3O4-MNPs,符合粉末衍射数据标准联合委员会(The Joint Committee on PowderDiffraction Standards,JCPDS)标准。(2)不同浓度的Fe3O4-MNPs对ConA刺激的脾淋巴细胞增殖及IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-4分泌无明显影响。(3)中、高剂量组的Fe3O4-MNPs可以提高小鼠正常机体的CD3+CD4+,CD3+CD8+细胞比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+细胞比值。(4)Fe3O4-MNPs各剂量组和对照组对组织器官无组织病理学损害。