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猪链球菌2型(Streptocuccus suis2, S. suis2)是一种非常重要的猪病原菌,可以引发猪的关节炎,心内膜炎,脑膜炎,肺炎和败血症,同时也可以引发人的致死性感染。近些年中国爆发的两次大规模S. suis2感染均引起人的中毒休克综合症,伴随有急性高热,多器官衰竭,病程短,致死率高的特点。这引发世界公共卫生的极大关注。近年来,国内外针对S. suis2开展了大量研究工作,然而对其迅速增强毒力的潜在机制知之甚少。双组分信号转导系统(two-component signal transduction systems, TCSTS)广泛存在于细菌中,该系统通过感受外界刺激来影响特定基因或操纵子的转录并调节细胞的变化,从而在调节细胞周期,发育途径,致病性等重要过程当中发挥的庞大的功能。关于双组分NisK/NisR,有报道认为它在乳酸乳球菌中调控乳链球菌素Z的合成；关于双组分BceR/BceS,它被证明在枯草芽胞杆菌参与形成四组分系统BceRS-BceAB,可以感知环境中抗菌肽并通过ABC运输蛋白将其从作用位点移走,从而提高细胞抵抗能力。然而这两对TCSTS在链球菌中的功能尚不清楚。NisK/NisR位于89K毒力岛上,该岛上另一对TCSTS SalK/SalR已报道是S. suis2高致病性的一个至关重要的因子。事实上很多双组分比如CiaRH, Ihk/Irr, VirR/VirS, RevS and CovR都已报道和S. suis2的致病性有关。因此,本课题以NisK/NisR和BceR/BceS为研究对象,探讨了这两对双组分对S. suis2毒力的影响,同时初步研究了两对系统可能调控的一些基因。主要研究内容：1. S. suis2双组分系统NisKR和BceRS基因缺失突变株的构建和鉴定依据猪链球菌二型05ZYH33全基因组序列设计引物。以SC19基因组为模板,温敏自杀性质粒pSET4s为穿梭载体,利用同源重组原理成功获得二次交换基因缺失突变株AnisKR和AbceRS,并通过PCR和Southern blot验证。2. S. suis2双组分系统NisKR和BceRS基因缺失突变株的生物学特性研究我们研究了突变株的生长特性和溶血活性,结果表明：野生株SC19相比,突变株在10%新生牛血清里的生长曲线无显著差异,但是溶血效价要降低2倍以上。我们进一步以小鼠和细胞为模型对基因缺失突变株AnisKR和AbceRS的毒力进行评价。细胞实验结果表明：AnisKR和AbceRS对Hela细胞的粘附能力显著降低(分别下降85.4%和53.05%),对该细胞的侵入能力也显著下降(分别下降90.9%和76.77%)；抵抗中性粒细胞(PMN)介导的杀菌作用的能力显著下降；更容易被小鼠肺泡巨噬细胞(RAW264.7)吞噬同时也更容易被该细胞杀死。BALB/c小鼠实验结果表明：以8×108CFU剂量的野生株和突变株分别腹腔注射1ml后观察到突变株组的临床症状较轻,死亡率显著低于野生株组；以5×107CFU剂量的野生株和突变株分别感染小鼠后,统计各个时间点血,心,肺,脑组织中的载菌量,发现突变株的含量显著低于野生株。这表明NisK/NisR和BceR/BceS在S. suis2致病过程中有着重要的地位。3. S. suis2双组分系统NisK/NisR和BceR/BceS调控机制的初步研究本研究提取各菌株RNA,通过转录组测序(RNA-seq)比较分析野生株和突变株的差异表达基因。结果显示：AnisKR中有22个基因下调2倍以上,7个基因上调2倍以上；AbceRS中有4个基因下调2倍以上,15个基因上调2倍以上。同时本研究成功的可溶性表达纯化了两个双组分的反应调控蛋白NisR和BceR,并首次尝试在S. suis2中建立DAP-seq (DNA Affinity Purification Sequencing)技术来寻找调控蛋白的结合位点,以便深入研究其调控机制。