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研究目的分析和探讨我国人群中基于转录组的肝细胞癌G1-G6分子分型对其生物学行为和临床病理特征的预测价值,同时重点研究与预后相关的危险因素,借此从肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）患者中筛选出复发和死亡风险率较高的群体,制定相应的个体化治疗方案,达到降低复发率及死亡率的临床应用价值。研究方法1、筛选107例2014年1月至2017年12月在福建医科大学孟超肝胆医院以肝癌切除术为首次治疗手段的原发性HCC患者,符合纳入标准并配有详细的临床资料和随访信息,用于回顾性队列研究。检测HCC患者G1-G6分子分型16个预测基因的表达,并代入由Boyault等人构建的数学模型中得出分型结果。2、整理HCC患者的临床病理资料和随访信息,使用卡方检验分析G1-G6分子分型与肿瘤生物学行为、患者临床特征、病理分型和血清标志物水平的相关性,使用Kaplan-Meier法及Cox回归评估G1-G6分子分型在HCC复发和临床预后中的意义。3、根据分子分型结果,使用随机分层抽样方法从福建HCC队列中抽取58例患者的石蜡包埋组织样本作为供体蜡块制作组织芯片。4、使用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）、蛋白质印迹法（Western blot,WB）和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）等方法检测G1-G6分子分型16个预测基因、程序性死亡受体配体1（Programmed death-ligand 1,PD-L1）、Wnt/β-catenin信号通路相关分子、上皮细胞-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关分子、肝癌干性相关分子在患者癌组织和癌旁肝组织中的表达,验证G1-G6分子分型法在我国人群中的适用性,并尝试评估其临床意义。5、通过转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）和生物信息学分析结合肿瘤基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）公共数据库探讨HCC术后复发相关靶点与分子信号通路。结果1、完成107例HCC患者的分子分型,分型分布如下,G1型19例,占17.76%;G2型2例,占1.87%;G3型共20例,占18.69%;G4型10例,占9.35%;G5型25例,占23.36%;G6型31例,占28.97%。2、相关性分析表明,G1-G6分子分型与患者肿瘤数目、血清甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）水平、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）DNA拷贝数、肝硬化以及微血管侵犯（Microvascular invasion,MVI）显著相关。其中,G1型与血清高AFP水平相关（P=0.001）;G3型与非单一梁索型组织学结构（P=0.021）和HBV DNA高拷贝数（P=0.014）相关;G4型与高龄（P=0.012）和HBV DNA低拷贝数（P=0.012）相关;G5型与单发肿瘤（P=0.013）和低MVI发生率（P=0.007）相关;G6型与Hep-Par1强阳性（P=0.007）相关。进一步统计分析发现,增殖类亚型（G1-G3型）与患者血清高AFP水平（P=0.002）、HBV DNA高拷贝数（P=0.047）、非单一梁索型组织学结构（P=0.010）、大血管侵犯（P=0.012）和Hep-Par1阴性/弱阳性（P=0.012）相关。3、通过Kaplan-Meier生存分析观察到G1-G3型HCC患者相对G4-G6型HCC患者具有更短的3年内总体生存时间（P=0.0102）,其中G3型预后最差（P=0.0125）。Cox回归单因素分析显示,TNM分期（P=0.0002）、BCLC分期（P=0.001）和G1-G6分子分型（P=0.012）是影响HCC患者总体预后的重要因素;进一步通过多因素分析发现G1-G6分子分型（P=0.035）是评估HCC患者总体生存的独立危险因素。4、通过qPCR检测发现G1-G3型HCC与AFP（P=0.0200）、钙黏蛋白2（Cadherin 2,CDH2）（P=0.0022）、木星微管相关同源物1（Jupiter microtubule associated homolog 1,HN1/JPT1）（P<0.0001）、NRAS（P=0.0096）、p21激活酶2（P21 activated kinase 2,PAK2）（P=0.0024）、RAB1A（P=0.0020）、SUMO1激活酶亚基1（SUMO1 activating enzyme subunit 1,SAE1）（P<0.0001）高表达相关;G4-G6型HCC与层黏连蛋白3α（Laminin subunit alpha,LAMA3）（P=0.0059）、再生家族成员3α（Regenerating family member 3 alpha,PAP/REG3A）（P=0.0495）高表达相关。5、使用IHC检测PD-L1 SP142、28-8和73-10在肝癌组织的表达,结果显示G1-G3型HCC较G4-G6型HCC具有更高的PD-L1蛋白表达。6、通过qPCR、WB和IHC方法验证发现G5和G6型与Wnt/β-catenin途径激活和EMT相关;肝癌干性相关指标Ep CAM和SOX9在G1-G3型HCC中高表达,进一步分析发现G1型HCC与肝癌干性尤其相关。7、通过RNA-seq结合TCGA数据库成功筛选出增殖类亚型（G1-G3型）与非增殖类亚型（G4-G6型）间的差异表达基因再生家族成员1β（Regenerating family member 1 beta,REG1B）、再生家族成员3γ（Regenerating family member 3 gamma,REG3G）和1型肌醇1,4,5-三磷酸受体（Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,ITPR1）,其中ITPR1与HCC预后显著相关（P=0.0041）,应用KEGG通路分析提示在G1-G3型HCC中钙信号通路、c GMP-PKG信号通路、肾素分泌、神经活性配体-受体相互作用和细胞代谢相关等信号通路明显富集。结论1、在人群不同和使用qPCR SYBR Green I荧光染料法取代Taq Man探针法的情况下,G1-G6分子分型法在福建HCC队列中也同样适用。2、HCC患者分子分型为G1-G3型可作为评估患者预后的独立危险因素,与患者肝癌切除术后预后不良显著相关,其中G3型预后最差。3、成功验证G5和G6型与Wnt/β-catenin途径激活相关。有别于其他相关研究,发现G1-G3型与PD-L1表达和钙信号通路激活等因素相关,G1型与肝癌干性相关。4、基于RNA-seq和TCGA数据库,发现ITPR1在肝癌组织中高表达,与患者不良预后相关,是一种潜在的生物标志物。