人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）在全球广泛传播,自发现以来已超过7000万人感染,据联合国艾滋病规划署（UNAIDS）数据统计全球现存HIV-1感染者约为3690万,每年新增HIV-1感染人数约为180万,死亡人数约94万。HIV-1主要感染人体CD4+T淋巴细胞,破坏机体免疫系统,患者疾病进程发展为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）时容易发生机会性感染而死亡。由于HIV-1感染后病毒基因组整合至宿主细胞中,成为病毒潜伏库,一旦感染需终身治疗,主要的治疗方式为抗病毒药物治疗,可控制病毒载量,延长患者寿命,然而抗病毒药物具有毒副作用、易出现耐药性等问题。关于HIV-1疫苗的研究从未中断,全球每年投入大量的科研经费用于疫苗研发,但是当前仍无有效的疫苗可用于防止HIV-1感染与传播,HIV-1疫苗研究充满了困难与挑战。HIV-1 Env膜蛋白是病毒颗粒表面的唯一蛋白,是广谱中和抗体识别的靶点。近年来大量广谱中和抗体的分离与结构解析,鉴定了 Env膜蛋白上的重要广谱中和表位。同时通过真核细胞表达改造后稳定的Env膜蛋白胞外区gp140蛋白及其结构解析,为HIV-1疫苗开发提供了更多的候选免疫原。然而,研究表明真核表达的gp140三聚体蛋白与病毒颗粒上天然Env膜蛋白结构存在差异,gp140三聚体蛋白不能完全代表天然Env膜蛋白结构。由于病毒颗粒上仅含有10-14个Env三聚体,数量少且处于亚稳定状态,容易发生构象变化,因此在含有膜的条件下进行全长天然HIV-1 Env膜蛋白结构解析具有极大的困难,目前仍没有天然Env膜蛋白的高分辨率结构。首先,本研究一方面对NL4-3病毒天然Env膜蛋白进行纯化条件摸索与优化,在env序列C端分别添加His和Flag标签,病毒检测结果说明Flag标签改造未明显影响病毒感染性和Env膜蛋白表达量,确定了以Flag标签进行亲和纯化的方式。另一方面,对本实验室现有的6种病毒进行鉴定分析,表明不同病毒的感染活性、p24含量与Env膜蛋白含量存在差异,其中pSG3.1病毒的Env膜蛋白含量最高。NL4-3、pSG3.1和JRCSF病毒天然Env膜蛋白的抗原性分析结果显示Env膜蛋白在构象上保留了多种广谱中和抗体表位,包括CD4 binding site、Glycan-V3、MPER等。同时,本研究首次尝试通过冷冻电镜单颗粒三维重构的方法对NL4-3病毒天然Env膜蛋白进行结构解析,但未能获得正确的Env结构。其次,NL4-3病毒天然Env膜蛋白免疫BALB/c小鼠刺激产生了中和抗体应答,Env免疫组小鼠的抗体组高通量测序分析发现,与gp140蛋白免疫组类似,抗体的重链和轻链大量使用了 IGHV1和IGKV4家系基因,产生了针对相同表位的抗体应答;同时,Env膜蛋白免疫产生了与本实验室已知的靶向MPER表位的鼠源抗体25G8序列一致性高于95%的PGM抗体,同源模建与分子对接结果显示PGM抗体与MPER肽复合物具有更强的结合能力和更低的能量值。再者,本研究对Env膜蛋白胞外区和近膜区免疫原开展研究,一方面在gp120和gp120V3环区缺失蛋白的免疫中对比了三种佐剂（A1002、FH-002B-RS和FH-003B-ZL）的免疫效果,血清检测结果显示三种佐剂都刺激Th2类体液免疫应答,并且gp120蛋白免疫中显示A1002在提高抗体的中和宽度方面优于FH-002B-RS和FH-003B-ZL。在gp120、gp140和相应V3环区缺失蛋白的免疫中结果显示低剂量连续免疫的方式相比常规免疫可以在短时间内更快提升血清抗体滴度,并且在gp120和gp140蛋白低剂量连续免疫中显示序贯免疫在提高抗体的中和宽度方面优于混合免疫。V3区缺失的胞外区免疫原可产生针对V1V2、CD4 binding site表位的抗体应答,免疫血清具有中和活性,并且无针对V3区表位的抗体反应性。另一方面,本研究首次解析了 T=4的HIV-1衣壳突变体蛋白（CA N21C/A22C）二十面体结构,并将其作为载体蛋白展示10E8抗体识别的近膜区表位。10E8表位展示的融合蛋白显示较好的抗原性,同时免疫原性检测结果显示其免疫血清具有中和活性。综上,本论文在HIV-1病毒天然Env膜蛋白、Env膜蛋白胞外区与近膜区免疫原的探索性研究是HIV-1疫苗研发的重要方面,所得的结果为进一步纯化与解析天然Env膜蛋白结构及基于天然Env膜蛋白结构的疫苗设计奠定了基础,也为胞外区免疫原及基于近膜区表位的免疫原设计提供了重要信息。