白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）是水生甲壳类动物最严重的致病性病原之一,给世界虾类养殖业带来巨大的经济损失。WSSV是一种具有囊膜、核衣壳的双链DNA病毒,属于线头病毒科（Nimaviridae）,白斑病毒属（Whispovirus）。迄今为止,关于WSSV感染宿主细胞的内化机制已经被阐明,但是随后宿主细胞对WSSV的囊泡转运和内体穿出机制尚不清楚。本文以红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）造血组织（Haematopoietictissue,Hpt）细胞为研究模型,观察WSSV感染诱导的囊泡转运阶段并分析该过程的功能与关键调控机制,以期为抗WSSV感染提供理想的靶点。首先,本文发现内化的WSSV经内吞囊泡转运至内体系统,然后伴随内体系统的动态转运,WSSV完成其囊膜融合并释放其核衣壳进入细胞质。通过实时共聚焦技术,本文首次监测到内体运输WSSV的动态转运过程。超微结构分析显示WSSV囊膜融合促使包含核酸的核衣壳释放进入细胞质。免疫荧光技术显示内体成熟过程中酸化过程促进WSSV囊膜与核衣壳的分离,然而内体的碱化滞留内吞的WSSV于损伤的内体。同时,抑制WSSV囊膜解离显著减弱病毒的晚期复制,说明病毒利用宿主细胞内体系统完成核酸逃逸。依据这一机制,碱化剂氯喹和氯化铵以及囊泡V-ATPase抑制剂巴佛洛霉素均可显著阻滞WSSV的内体转运。然而,抑制调控多囊泡体形成的PIKfyve活性不能阻断WSSV的囊膜融合和病毒复制。因此,早期内体的酸性环境是驱动WSSV囊膜融合和核衣壳释放的先决条件,这促使WSSV能够成功跨膜传递其基因组至复制位点。其次,本研究发现红螯螯虾含缬酪肽蛋白（CqVCP）促进WSSV穿出限制性内体进入细胞质。有趣的是,WSSV感染增强红螯螯虾Hpt组织CqVCP的mRNA和蛋白水平。基因干扰或药理学抑制CqVCP阻断WSSV在Hpt细胞内的转运并抑制WSSV的基因复制。抑制剂DBeQ与CqVCP的结合通过扰乱内体的酸化而强烈地抑制核衣壳由内体释放进入细胞质:伴随麦乳糖凝集素WGA标记的内体转运,内化的WSSV被阻滞在碱化的内体区室;滞留于损伤内体的WSSV与RabGEF1和CqVCP共定位,说明CqVCP贡献于低pH驱动的WSSV囊膜解离;超微结构分析显示滞留于损伤内体的WSSV颗粒形成病毒聚集体。与DBeQ不同地是,VCP变构抑制剂NMS873通过抑制内吞囊泡与内体的膜融合而阻断内化的WSSV传递至内体。相同地,DBeQ和NMS873都通过预先阻止细胞内病毒转运而有效地抑制子代病毒的核内组装。另外,使用MLN4924和MG132抑制CRLs-proteasome通路不能有效地抑制内体逃逸和病毒的复制,表明CqVCP参与的蛋白酶体功能未涉及内体酸化机制。因此,CqVCP功能障碍不仅抑制内吞囊泡至内体的传递,而且通过扰乱内体的酸化有效地滞留侵袭的WSSV于损伤的内体。第三,本研究发现宿主细胞利用损伤内体介导的自噬去隔离和清除滞留内体的WSSV。DBeQ以剂量依赖地方式促进自噬分子CqGABARAP脂化并增强其修饰WSSV和WGA定位的内体。NMS873和巴佛洛霉素预处理则能显著阻止DBeQ引起的自噬起始,说明Hpt细胞内DBeQ通过CqVCP-V-ATPase通路激活内体介导的自噬。另一方面,CqVCP通过V-ATPase维持内体的酸化而促进WSSV的内体逃逸。另外,AKT抑制剂AKTi 1/2以剂量依赖的方式促进CqGABARAP脂化并促使其修饰WSSV/WGA滞留的内体。与DBeQ相类似,在AKTi1/2预处理的Hpt细胞中,内体包含的WSSV显著聚集形成病毒聚集体并限制病毒的囊膜解离。不同的是,AKTi 1/2处理增强酸化和组织蛋白酶活性以降解隔离的WSSV。通过比对内化病毒的隔离效应,AKTi 1/2要显著弱于DBeQ并且二者无叠加效应。同时,NMS873预处理则拮抗Hpt细胞内AKTi 1/2诱导的内体聚集和酸化。这些结果说明AKT或许居于CqVCP的上游以限制损伤内体介导的自噬而有益于WSSV完成自身的内体逃逸。综上所述,在细胞质转运阶段,内体系统的成熟促进WSSV感染而自噬作为宿主细胞的防御机制拮抗WSSV感染。尤其重要的是,病毒囊膜与早期内体膜的融合是WSSV跨膜传递其基因组的极其关键事件,并且CqVCP-V-ATPase通路通过维持内体的酸化以促进其核衣壳释放。同时,在WSSV感染的Hpt细胞中AKT或CqVCP促进WSSV基因组由内体逃逸以避免宿主细胞内防御性自噬。因此,以AKT-CqVCP信号通路为靶标激活内体介导的自噬则显著地限制WSSV的内体逃逸,这为早期阶段有效抵御WSSV感染转运提供了重要防治策略。