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背景:恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)是最具侵袭性的皮肤肿瘤之一,其大约占全部肿瘤病例的1%,但却是所有恶性肿瘤中发病率增长最快的,年增长率达3%-7%[1]。目前,关于黑色素瘤的治疗方法众多,其中主要以手术切除为主,其它治疗包括放化疗、分子靶向治疗、免疫治疗等,但这些方法多存在毒副作用大、耐药性高且对已转移的病灶治疗效果欠佳等不足。因此,寻求低毒、高效的药物和治疗手段成为研究热点。近年来,一些天然植物提取物因其分布广泛、取材方便、毒副作用小、价格低廉、药理作用广而在肿瘤的治疗方面展现了广阔的应用前景。白藜芦醇(Resveratrol,Res)作为一种天然多酚类植物提取物,被证实具有抗肿瘤、调节免疫、抑制血管生成等多种生物学功效。同时,许多学者通过细胞实验及动物实验证实白藜芦醇能对抗黑色素瘤、肝细胞癌、白血病、乳腺癌、卵巢肿瘤等肿瘤细胞增殖,并可以诱导肿瘤细胞的凋亡,但其具体的作用机制未被完全认识。PI3K/AKT/m TOR作为重要的信号通路之一,被证实在多种人类肿瘤如恶性黑色素瘤、胃癌、白血病等中存在异常激活,其异常激活导致通路中的某些组分的突变进而引起下游调控细胞周期、细胞增殖、凋亡、转化等过程相关蛋白的表达失调,最终引起肿瘤的发生及发展。目前,针对该通路的靶向治疗药物有限,且多局限于体外研究阶段,其有效性及毒副作用仍需进一步探索。雷军荣[2]等曾报道白藜芦醇可以通过PI3K/Akt/m TOR信号通路降低小鼠心肌细胞的缺血再灌注损失;Jiang H[3]等研究显示白藜芦醇能通过下调PI3K/Akt/m TOR信号通路抑制胶质瘤的增殖;本课题组推测白藜芦醇的抗黑色素瘤作用可能与PI3K/Akt/m TOR信号通路相关,作了关于白藜芦醇通过PI3K/Akt/m TOR信号通路对人黑色素瘤A375细胞系(简称A375细胞)增殖的调控的研究,为该药物被应用于黑色素瘤的治疗提供依据。目的:研究白藜芦醇对A375细胞增殖的作用及对细胞周期的影响,以及可能存在的作用机制,是否存在PI3K/Akt/m TOR信号通路的参与,及该通路相关蛋白及下游蛋白PI3K、Akt、p-Akt、p-m TOR、cyclin D1、P21的表达情况,从而为白藜芦醇应用于黑色素瘤的治疗提供理论和实验依据。方法:1.分别用浓度为0μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的白藜芦醇处理A375细胞24h,观察各组细胞形态的变化情况;采用CCK8法检测各组细胞的增殖抑制率。2.分别用浓度为0μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的白藜芦醇处理A375细胞24h后,应用流式PI染色法检测各组的细胞周期变化情况。3.应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、p-Akt、p-m TOR和下游周期蛋白cyclin D1、细胞周期调控因子P21的变化情况。结果:1.采用浓度为0μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的白藜芦醇处理A375细胞24h后,发现各组细胞形态表现为随着药物浓度的增加,细胞逐渐缩小变圆变亮,细胞间隙增宽。运用CCK8法检测细胞的增殖抑制率,发现细胞的增殖抑制率随着药物浓度的增加而增加(P<0.05),具有统计学差异。2.经不同浓度白藜芦醇处理后,处于G2/M期、S期的A375细胞随着药物浓度的升高而逐渐减少,而处于G0/G1期细胞的百分比增多。24h时A375细胞G2/M时相的比例,在空白对照组(0μmol/l)占23.18±2.14%,实验组(25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l和200μmol/l)分别占19.73±1.92%,15.47±2.01%,11.61±1.82%,5.63±0.89%。各实验组的不同时相与对照组相比,P均<0.05,差异有统计学意义。3.Western blot显示:24h时,A375细胞中PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白PI3K、p-Akt、p-m TOR的表达随着药物浓度的增加呈现出逐渐降低的趋势(P<0.05),有统计学差异;Akt的表达未见明显趋势(P>0.05)。周期蛋白cyclin D1的表达随着药物浓度的增加,表现出逐渐降低的趋势(P<0.05),有统计学差异;周期蛋白调控因子P21的表达逐渐增多,高浓度白藜芦醇处理组的P21蛋白表达明显较低浓度组高(P<0.05)。结论:1.白藜芦醇通过药物浓度依赖性趋势抑制A375细胞增殖。2.白藜芦醇抑制A375细胞增殖的作用机制可能与其抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路的活性密切相关。3.白藜芦醇抑制A375细胞增殖的作用机制与其调节PI3K/Akt/m TOR信号通路下游周期抑制因子P21和周期蛋白cyclin D1的表达存在相关性。