【摘 要】
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目的:研究大鼠颈总动脉球囊损伤后胞浆泛素蛋白连接酶1(KPC1)在新生内膜中的表达特征及生物学功能。方法:采用贴壁法培养大鼠原代VSMC后进行免疫荧光染色检测VSMC特异性标志
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目的:研究大鼠颈总动脉球囊损伤后胞浆泛素蛋白连接酶1(KPC1)在新生内膜中的表达特征及生物学功能。方法:采用贴壁法培养大鼠原代VSMC后进行免疫荧光染色检测VSMC特异性标志α-SMA,建立体外增殖模型后运用qRT-PCR及western blot检测KPC1 mRNA、蛋白表达特征,划痕试验检测VSMC迁移情况。利用RNAi技术构建针对KPC1基因的Ad-shKPC1腺病毒载体,运用AD293细胞进行病毒载体包装和扩增,纯化后将其转染VSMC收取蛋白行western blot检测KPC1蛋白表达情况。将成年雄性SD大鼠(450～550 g)随机分为颈动脉球囊损伤实验组和假手术组。实验组于损伤后1、3、7、14、28 d分别处死SD大鼠并取材,采用western blot检测KPC1蛋白、内膜增殖细胞核抗原表达情况,以qRT-PCR检测KPC1的mRNA水平,HE染色后比较内膜增生程度。检测过表达KPC1对新生内膜形成的影响,将SD大鼠随机分为3组,即假手术组、Ad-Null组、Ad-KPC1组,假手术组不行球囊损伤,其余两组除球囊损伤外还分别给予40 ul Ad-Null病毒液和Ad-KPC1病毒液,HE染色后比较内膜增生程度,免疫组化染色检测KPC1、CNN1及CD31表达水平,Evans blue染色检测损伤血管段再内皮化情况。结果:采用贴壁法成功培养出原代VSMC,免疫荧光染色检测α-SMA阳性细胞数达95%以上,PDGF-BB刺激VSMC体外模拟增殖后行qRT-PCR和western blot检测示KPC1mRNA、蛋白表达逐渐减低,划痕试验示过表达KPC1明显抑制VSMC迁移。利用RNAi技术构建针对KPC1基因的Ad-shKPC1腺病毒载体,可有效抑制KPC1蛋白的表达。颈总动脉球囊损伤后新生内膜增生随着时间的延长逐渐加重,14 d时管腔明显狭窄,内膜厚度超过中膜,28 d时腔狭窄程度继续加重,狭窄超过50%。qRT-PCR及western blot检测结果示颈动脉球囊损伤后实验组KPC1 mRNA、蛋白表达水平明显低于假手术组(P<0.05),而PCNA表达水平明显高于假手术组(P<0.05)。过表达KPC1后新生内膜形成明显受到抑制(P<0.05),KPC1、CNN1及CD31表达水平明显增加(P<0.05),颈总动脉损伤段血管再内皮化加速。结论:KPC1可能通过影响VSMC表型转换抑制新生内膜增生。
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