胶原纤维内矿化是牙、骨等硬组织优异力学性能和生物学功能发挥的重要结构学基础,其中胶原纤维、无定形磷酸钙矿化前体（Amorphous calcium phosphate,ACP）和非胶原蛋白（Non-collagenous proteins,NCP）一直被认为是完成纤维内矿化的三个核心要素,其中ACP被认为是纤维内矿化发生的最重要的矿物基础。在生理发育期的小鼠颅骨及长骨中,细胞可分泌ACP;在病理性血管矿化过程中,也存在ACP的参与。然而,ACP通常不稳定,容易发生相转变,而使纤维内矿化受阻。因此,传统的矿化理论认为,带有聚阴离子性质的NCP一方面可稳定ACP以提供胶原矿化原料,另一方面可修饰胶原蛋白以调控纤维内矿化的形成,是调控整个矿化过程的关键。但是,近年来越来越多的研究表明,当敲除某些关键的NCP相关基因后,小鼠的成骨及矿化过程并未受到影响;另有学者发现在成骨细胞的矿化活动中,NCP诱导的纤维内矿化并非是生物矿化的唯一途径。这些结果提示,除NCP外,仍有我们未发现的天然生物分子在生物矿化的调控中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,成骨细胞所分泌的细胞外囊泡中除了含有NCP,还含有大量生物大分子—核酸。此外,在胆结石、血管钙化、乳腺癌微钙化等病理性钙化标本表面,同样可检测到大量的细胞外核酸聚集。值得注意的是,与NCP相似,核酸同样具有聚阴离子特性,其简单有序的分子结构、氢键等非共价键的相互作用、高电荷密度的磷酸基团等特性赋予了核酸优异的灵活性和生物相容性。但是,一直以来核酸分子在生物矿化过程中的作用被局限于遗传信息的储存、复制、传递和辅助蛋白质的合成加工,而并非作为原料直接参与矿化。核酸作为天然的聚阴离子,理论上具有极强的稳定钙磷离子,形成ACP并促进基质矿化的作用,但却从未得到证实。那么,核酸在生物矿化中的作用是否一直未引起重视?核酸是否具有调控矿物形成及基质矿化的功能呢?其生物学意义又是什么呢?针对上述问题,本研究通过体外仿生矿化手段同步联合多种新型表征技术探究核酸对ACP的稳定作用及稳定机理,并结合仿生矿化理念进一步探究核酸稳定的ACP（核酸-ACP）对胶原纤维内矿化的作用及矿化机制。基于上述核酸调控矿化的新功能,我们深入探究了核酸调控生物矿化过程中的两个重要生物学问题:即DNA-ACP促进病理性钙化发生的新机制及RNA-ACP在硬组织修复再生中的新运用。以上研究打开了生物矿化的一个崭新领域,既为核酸参与生物矿化提出了新机制,又为病理性钙化相关疾病的阻断及硬组织缺损修复材料的研发提供新策略。1.研究方法在第一部分实验中,我们首先探究了核酸对过饱和钙磷溶液的稳定作用（核酸-ACP制备）,其次探究核酸稳定过饱和钙磷溶液的机理及核酸-ACP的形成机理。我们首先提取细胞内的DNA和RNA,并利用体外仿生矿化手段,将其分别与高浓度钙磷溶液相配比,最终得到清亮无沉淀的DNA或RNA稳定过饱和钙磷溶液（DNA-CaP 及 RNA-CaP）;使用动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）及 zeta 电位检测DNA-CaP及RNA-CaP的水合直径及电位大小;利用扫描电镜（Scanning electron microscopy,SEM）,观察样品的微观形貌;利用红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）表征样品的特征性官能团的振动进一步确定其理化性质;通过透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）、元素能谱联合选区电子衍射分析样品中的元素分布、样品颗粒形貌及矿物晶型;利用冷冻电镜及选区电子衍射技术实时捕捉DNA-ACP及RNA-ACP的形成状态及形貌特征;利用分子模拟进一步再现DNA-ACP及RNA-ACP的形成过程,并对上述实验结果进行深入分析,探究核酸对ACP的稳定作用及核酸-ACP复合体的形成机理。在第二部分实验中,我们首先探究了 DNA-ACP或RNA-ACP对胶原纤维内矿化的影响,其次探究了核酸-ACP介导胶原纤维内矿化的机制。我们将二维胶原矿化模型（Ⅰ型鼠尾胶原）及三维胶原矿化模型（牛跟腱来源Ⅰ型胶原支架及脱矿牙本质来源Ⅰ型胶原支架）与第一部分所制备的DNA-ACP或RNA-ACP矿化液共孵育,进而评估其介导胶原纤维内矿化的作用及矿化的效率。利用TEM、元素能谱及选区电子衍射表征矿物的沉积位置、胶原内部矿物晶体取向及晶体的转变情况;利用SEM观察胶原纤维矿化前后形态变化;利用冷冻电镜联合选区电子衍射及三维重建技术,表征胶原纤维的实时矿化过程。由于实验结果显示DNA-ACP或RNA-ACP具有相似的理化性质（如颗粒形貌、颗粒均带负电荷、相似的形成过程及形成机理）,且均具有诱导胶原纤维内矿化的功能,我们选择更易表征的DNA作为代表性核酸（如分子量设计、荧光染色代表性强等优势）,以探究核酸-ACP介导胶原纤维矿化的机制。通过荧光染色分析矿物及DNA在胶原纤维上的分布;醋酸双氧铀染色确定DNA在胶原纤维上的结合位点;利用聚阴离子改性的胶原纤维模型,探明胶原纤维与DNA的吸附作用;利用FTIR探究DNA与胶原纤维之间的结合方式;利用分子模拟验证DNA与胶原纤维之间的相互作用力及再现DNA与胶原纤维的结合形式;利用不同分子量DNA进一步探究DNA分子量的改变对胶原纤维矿化的影响,从而阐明胶原、核酸与矿物之间的关系及核酸诱导胶原内矿化的新机制。在第三部分实验中,结合病理性钙化标本表面有大量细胞外DNA沉积的现象,我们首先探究了异位钙化发生与DNA沉积的相关性,其次探究了核酸酶的参与对胶原矿化的调控作用及对细胞外基质病理性钙化的阻断效果。我们以三种体内病理性钙化模型（心脏瓣膜异位钙化模型、肌肉异位钙化模型及跟腱异位钙化模型）及体外血管平滑肌细胞（Mouse vascular smooth muscle cells,VSMCs）病理性钙化模型为研究对象,利用TEM及免疫荧光表征上述病理性钙化条件下胶原纤维钙化的形式及其与DNA沉积的相关性。随后,我们通过在小鼠后肢肌肉内植入含有DNA-ACP的胶原支架,进一步探究DNA-ACP是否具有体内诱导异位钙化形成的作用。在植入3周后取材,利用显微CT（Micro-computed tomography,Micro CT）及三维图像重建技术对组织中的异位钙化进行成像观察;利用免疫荧光表征DNA-ACP是否参与到了异位钙化形成过程;利用TEM及SEM,进一步从更微观的角度探究DNA-ACP诱导的异位钙化中的胶原纤维矿化形式。随后,我们通过在DNA-ACP体系中引入DNA酶（DNase）,降解核酸,采取体外实验评估DNase的添加对胶原纤维内矿化的影响及对细胞介导的基质钙化过程的影响。利用免疫荧光及茜素红染色等方法对DNase抑制基质钙化能力进行评估,进而抑制细胞介导的病理性钙化的形成。以上研究是基于核酸稳定ACP介导生物矿化过程的第一个生物学意义,即DNA-ACP介导病理性钙化发生机制研究。此外,我们通过在RNA-ACP体系中加入RNA酶（RNase）,以证实特异性核酸酶抑制核酸介导的胶原纤维内矿化具有普适性,也为后续RNA-ACP用于骨缺损修复材料提供实验依据。在第四部分实验中,基于RNA作为矿化诱导剂可快速诱导胶原纤维发生矿化的创新性结果及采用RNase更易调控RNA的降解,继而可控改变胶原纤维矿化过程的特性,我们制备出了 RNA-ACP复合胶原支架材料（RNA-ACP-胶原支架）以及具有可控矿化功能的含RNase的RNA-ACP的胶原支架（RNase-CaP-胶原支架）;评估了上述材料的体内骨缺损修复效果,并探究了该材料促成骨修复机制。首先,我们构建了小鼠颅骨缺损的动物模型,并将RNA-ACP-胶原支架、RNase-CaP-胶原支架或空白对照胶原支架植于颅骨缺损处,于植入后的3周和6周取材。利用Micro CT、三维重建及定量分析,评估骨缺损的修复情况;利用未脱钙小鼠颅骨硬组织连续切片对样品进行HE染色、von Kossa染色及Masson染色等组织化学染色及半定量分析,评估颅骨缺损修复术后3周及6周,新生骨组织的形成情况及修复效果。随后,通过体内及体外实验,进一步探究上述支架材料的生物相容性、其对胶原纤维矿化的影响及促成骨机制。利用CCK8评估上述支架材料对小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMSC）的细胞初期黏附及细胞增殖的影响;利用免疫荧光染色表征细胞在上述支架材料中的形态变化及胶原纤维的矿化情况;利用SEM、TEM表征细胞在上述组别中的铺展粘附情况、胶原纤维矿化形式及细胞超微结构变化;利用实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测细胞在上述条件下的成骨及自噬相关基因的表达情况;利用免疫荧光表征细胞成骨分化相关蛋白,骨钙素（Osteocalcin,OCN）及自噬相关蛋白—微管蛋白轻链3（Light chain 3,LC3）的表达情况,进一步明确RNA-ACP或RNase-CaP调控骨缺损修复的机制。以上研究是基于核酸稳定ACP介导生物矿化过程的第二个生物学意义,即RNA-ACP复合胶原支架材料促进硬组织缺损修复再生的生物学运用。2.研究结果第一部分核酸稳定无定形磷酸钙的制备及其稳定机理探究（1）DLS结果显示单纯DNA及RNA的粒径较小,分别在13.0 nm及11.0 nm,在加入钙磷溶液后,DNA-CaP的粒径增大至52.4nm,RNA-CaP的粒径增大至29.6 nm。Zeta电位结果显示单纯DNA及RNA溶液的电位分别为-37.7 mV及-28.4 mV,在加入钙磷溶液后,DNA-CaP及RNA-CaP的电位值分别增高至-19.7 mV及-10.3 mV。SEM结果显示,DNA-CaP组及RNA-CaP组中呈现出形态大小较为均匀的球形纳米颗粒。FTIR结果表明,DNA-CaP及RNA-CaP组中出现v3（PO4）弯曲振动峰,提示ACP的形成。以上结果表明,核酸（DNA及RNA）作为聚阴离子的生物大分子,可能通过与钙离子之间的电荷相互作用,参与稳定ACP,并形成核酸-ACP（DNA-ACP及RNA-ACP）纳米颗粒复合物。（2）TEM结果显示,DNA-ACP及RNA-ACP为均匀的球形颗粒,元素能谱结果表明,钙磷元素与核酸来源的氮元素出现了明显的共定位,表明核酸参与ACP的形成。选区电子衍射结果表明,DNA或RNA参与所形成的ACP的晶型为无定形状态,证实ACP的形成。冷冻电镜及选区及电子衍射结果显示,DNA-ACP及RNA-ACP均为较规则的无定形圆形纳米颗粒,并由直径约1 nm的钙磷矿化前体即预成核簇（Prenucleation cluster,PNC）聚集所形成。分子模拟结果进一步表明DNA-ACP及RNA-ACP的形成过程。当在DNA或RNA体系中加入钙离子,钙离子会不断聚集在其链的周围;当在DNA或RNA-Ca2+体系中继续添加HPO42-离子时,HPO42-离子也进一步在DNA或RNA周围发生聚集,同时HPO42-与Ca2+离子之间也会不断发生吸附,在DNA或RNA链上形成PNC,PNC继而不断聚集,最终形成DNA-ACP或RNA-ACP。此外,在RNA体系中,RNA链之间还会发生钙离子浓度依赖型自组装,形成具有特定空间结构的RNA-ACP。以上结果揭示了核酸稳定过饱和钙磷溶液形成核酸-ACP复合体的机理。第二部分核酸稳定无定形磷酸钙介导胶原矿化及其机制探究（3）SEM及TEM结果显示,三维胶原支架在核酸-ACP矿化液（DNA-ACP或RNA-ACP）中矿化5天后,胶原直径因矿物沉积而明显增粗,同时胶原纤维内部聚集大量矿物,表明胶原已发生纤维内矿化。冷冻电镜及三维重建结果显示,胶原纤维在上述核酸-ACP溶液中矿化3小时后,ACP已渗入至胶原纤维内部;矿化5小时后,胶原纤维矿化程度进一步增强;矿化24小时后,胶原纤维内部完全由矿物所充填。选区电子衍射结果显示,矿化24小时后,纤维内沉积的矿物为沿着胶原长轴有序沉积的羟基磷灰石（Hydroxyapatite,HAP）晶体,提示胶原纤维发生完全纤维内矿化。因此,以上研究证实,DNA-ACP及RNA-ACP均可引起胶原纤维内矿化,同时具有优异的矿化诱导效率。（4）由于DNA-ACP及RNA-ACP的理化性质相似,且均可高效引起胶原纤维的矿化,我们选择了更易表征的DNA作为代表性核酸探究其介导胶原纤维内矿化的机制。荧光染色及钌红联合醋酸双氧铀染色结果显示,阴离子性质的DNA分子可与胶原纤维发生紧密吸附,即使是经过聚阴离子改性的带负电荷的胶原纤维表面仍能结合大量DNA,而矿化5天后的胶原纤维表面仍可检测到DNA的存留。以上结果提示阴离子DNA吸附至胶原纤维表面的作用力并不限于静电作用力。FTIR结果进一步表明,当DNA吸附在胶原纤维表面后,氢键吸收峰明显增宽,氢键数量增多。分子模拟结果证实范德华力、非极性溶剂化力及氢键是促进DNA吸附至胶原纤维的主要作用力。通过探究DNA诱导胶原纤维发生矿化的影响因素,我们发现小于40 kDa的低分子量DNA无法诱导胶原纤维的矿化,而高于40 kDa分子量的DNA可介导矿物在胶原纤维内发生沉积。以上结果证实高分子量的核酸可通过氢键等作用力与胶原纤维发生吸附,从而快速诱导胶原纤维发生矿化的机制;同时也提示我们可以通过调节核酸的分子量对矿化过程进行调控。第三部分DNA稳定无定形磷酸钙介导异位钙化及体外阻断策略（5）TEM结果表明,在心脏瓣膜、肌肉及跟腱的异位钙化样本中,胶原纤维内部有大量矿物聚集,表明病理性矿化胶原以纤维内矿化形式存在。免疫荧光结果显示,在上述三种体内异位钙化模型及体外VSMCs异位钙化模型中,胶原基质钙化处,存在大量的DNA沉积,表明体内外异位钙化模型中胶原基质的矿化与DNA沉积存在相关性。Micro CT的三维图像重建结果显示,在小鼠后肢肌肉内植入DNA-ACP胶原支架3周后,即可观察到明显的类骨质样结节形成。免疫荧光结果证实,DNA-ACP诱导的异位钙化中存在钙元素及DNA的共定位,提示DNA参与到了异位钙化的形成过程。TEM及SEM结果进一步表明,DNA-ACP能在体内诱导胶原出现纤维内矿化,再现了异位钙化形成的本质。因此,异位钙化区的细胞外DNA沉积很可能是病理性钙化发生的重要启动因素。（6）TEM结果表明,当胶原纤维在DNA-ACP体系中共孵育5天后,胶原发生纤维内外矿化。但是,当在DNA-ACP体系中加入DNase后,胶原纤维的外部仅有少量矿物沉积,而胶原纤维内部则无矿物形成,表明胶原纤维的矿化过程因加入DNase的作用而受到明显抑制。在小鼠成骨前体细胞（MC3T3-E1）介导的基质钙化过程中,免疫荧光染色结果表明DNA沉积与基质钙化呈现明显的正相关,添加DNase不仅能减少DNA的沉积,还可降低MC3T3-E1的基质钙化程度。茜素红染色及定量分析结果也同步证实,MC3T3-E1的基质钙化程度与未添加DNase的对照组相比显著降低（P＜0.001）,矿物生成受到明显抑制。此外,在VSMCs血管内皮细胞的体外病理性钙化模型中引入DNase后,与未添加DNase的对照组相比,其基质钙化程度也受到了明显抑制（P＜0.01）。由此,我们发现DNase可通过降解细胞外DNA,抑制胶原纤维的矿化及细胞外基质的钙化,DNase的运用或许可有效抑制体内多组织胶原纤维及细胞外基质的病理性钙化。此外,在RNA-ACP体系中,RNase的添加同样可以抑制胶原纤维的矿化。因此,特异性核酸酶的运用对于核酸介导的体外胶原纤维的矿化过程均具有普遍抑制作用。第四部分RNA稳定无定形磷酸钙复合胶原支架修复骨缺损（7）Micro CT结果表明,小鼠颅骨缺损修复术后3周,RNA-ACP-胶原支架组（RNA-ACP组）中出现新生的骨组织,缺损范围缩小,在术后6周,RNA-ACP组中新骨大量形成,充填至原缺损区。而RNase-CaP-胶原支架组中（RNase-CaP组）,术后3周及6周的新骨形成受到明显抑制,仍能观察到大面积骨缺损存在,表明RNA-ACP组可实现骨缺损区的快速修复,RNase-CaP组可实现可控成骨的功能。硬组织切片染色结果与Micro CT结果吻合,在术后3周,RNA-ACP组中出现了新生骨组织,主要为松质骨,其中含有大量血管和骨髓腔结构,术后6周,RNA-ACP组的缺损区已完全由新生骨组织所充填。而在RNase-CaP组中,术后3周及6周后,缺损区仅有一层较薄的结缔组织相连,伴随少量骨组织形成,骨形成受到抑制。（8）CCK8结果表明,RNA-ACP-胶原支架可明显促进BMSC的早期黏附,且具有较好的生物相容性。免疫荧光染色及SEM结果表明,当细胞在RNA-ACP组培养24小时,底部的胶原纤维即可出现矿化,当培养至第7天时,胶原纤维发生了大量矿化,此时BMSC形态铺展,含有较多伪足。而RNase-CaP组中的细胞形态改变不明显,胶原纤维矿化受到抑制。qRT-PCR结果发现,细胞在RNA-ACP组培养至7天时,成骨相关基因表达显著上调（P＜0.001）,表明细胞已经发生成骨向分化,而RNase-CaP组成骨向分化并不显著。免疫荧光进一步显示,细胞在RNA-ACP组培养至7天时,成骨分化相关蛋白OCN在细胞内大量表达,但RNase-CaP组中,细胞的成骨向分化不明显。同时,在体内颅骨缺损修复术后1周,RNA-ACP组中OCN表达相较于RNase-CaP组及对照组均出现显著升高（P＜0.001）,表明RNA-ACP复合胶原支架可促进内源性细胞的快速成骨向分化。随后,我们进一步发现RNA-ACP组中BMSC在成骨向分化时,细胞内出现大量的自噬溶酶体,且其自噬相关基因表达也显著增加（P＜0.001）。动物实验结果证实,在骨缺损修复区成骨细胞自噬标记分子LC3的表达也升高。因此,含有RNA-ACP的复合胶原支架不仅具有良好的生物相容性,还可通过激活细胞自噬促进BMSC快速成骨向分化,继而快速调动机体的成骨活动,实现骨缺损高效修复;随着RNase的加入,既抑制了胶原纤维的矿化,又抑制BMSC的增殖和分化,减慢了体内成骨过程,最终实现可控成骨及可控矿化的功能。3.研究结论本研究证实生物大分子核酸不仅具有稳定过饱和钙磷溶液形成ACP、调控矿物形成及晶体转化的作用,同时具有高效诱导胶原纤维内矿化的功能。本研究进一步聚焦核酸对生物矿化的作用,阐明了胶原、核酸与矿物之间的关系及核酸诱导胶原矿化的机制,实现了生物矿化机理的突破。在此原创理论指导下,本研究首次发现细胞外DNA对病理性钙化形成的促进作用及其参与机制,提出了靶向降解细胞外DNA对病理性钙化疾病的防治新策略。同时,受核酸介导矿化的启示,本研究制备出具有可控矿化功能的RNA-ACP复合胶原支架材料,并阐明了其在骨缺损修复中的优异效果及相关机制,为硬组织缺损修复材料的研发提供了新方向。