牙周炎是发生于牙周支持组织的慢性炎症性疾病,其发病率高,所造成的牙周组织缺损和丧失是成人牙齿缺失的首要原因。传统的牙周治疗虽可控制局部炎症和疾病进程,却难以使破坏的牙周组织获得再生。随着组织工程技术的发展,利用干细胞和复合功能性生物材料,有望重建牙周组织的结构和功能,为牙周炎治疗和牙周缺损修复开辟了新的研究空间。牙周膜干细胞（PDLSC）在特定条件下,可诱导分化形成牙槽骨、牙周膜和牙骨质结构,是牙周组织再生研究常用的种子细胞。但是研究证实,牙周局部的炎性环境,极大地抑制了PDLSC的干性和多向分化潜能,从而影响牙周再生的治疗效果,但具体机制目前尚未研究清楚。由此可见,阐明炎性环境影响PDLSC成骨分化潜能的机制,进而建立针对性调控策略,是实现牙周组织再生的关键。自噬是细胞调控物质循环的生命活动,是细胞的适应性自我保护方式,有助于调控细胞内外压力,抵御多种病理性过程。研究表明,自噬和炎性环境中细胞的自我防御和稳态维持密切相关。与此同时,也有证据显示自噬参与了干细胞的成骨分化过程。基于细胞自噬,阐述炎性环境对PDLSC成骨分化潜能的影响和分子机制,有望为牙周再生治疗中干细胞命运的调控提供新靶点。纳米颗粒（NP）是一类具有特殊理化性能的生物材料,可作为功能性分子和遗传物质等药物的载体和控释工具,应用于组织工程和再生医学研究领域。近年来研究发现,NP进入细胞后,大部分被细胞囊泡包裹,转移并定位于自噬小体或溶酶体等结构,最终激活细胞自噬过程,提示NP本身就可能成为细胞命运调控的工具,其中金纳米颗粒（Au NP）在生物医药领域应用最为广泛。Au NP对细胞自噬的影响,不同研究间差异较大,甚至有学者得出相反的结论,我们推测可能与Au NP本身的特性、Au NP作用的细胞类型,以及细胞所处的微环境有关。Au NP对炎性环境下PDLSC的作用效果如何,其作用的具体机制均有待解答。为进一步揭示炎性环境对PDLSC的影响和分子机制,我们首先观察炎性环境对细胞成骨分化潜能和细胞成骨诱导中自噬的影响,阐明二者之间的关联;进一步通过细胞成骨诱导中自噬-溶酶体系统的功能的变化,剖析自噬-溶酶体机制在炎性环境影响PDLSC成骨分化中发挥的作用。最后,将Au NP引入炎性环境中PDLSC成骨分化调节,探索针对自噬-溶酶体机制逆转炎症环境对PDLSC影响的新思路。第一部分炎性环境对PDLSC成骨分化潜能及成骨诱导中自噬的影响目的:观察炎性环境对PDLSC生物学性能特别是成骨分化潜能的影响;探索炎性环境PDLSC成骨诱导中自噬和自噬流水平的变化;明确自噬在炎性环境影响PDLSC成骨分化潜能中的关键作用。方法:通过炎性细胞因子（TNF-α和IL-1β）培养（7 d及以上）建立炎性培养条件;以炎性培养条件下PDLSC（I-PDLSC）作为炎性环境下PDLSC的细胞模型,以正常培养条件下PDLSC为对照;观察炎性培养对PDLSC干性和多向分化潜能的影响;Western blot检测PDLSC和I-PDLSC成骨分化潜能和成骨诱导中的自噬水平;透射电镜观察两种细胞内自噬的特征性结构;mRFP-GFP-LC3腺病毒和Western blot进一步检测炎性培养条件对PDLSC自噬流的影响;Western blot和茜素红染色检测自噬的调控分别对PDLSC和I-PDLSC成骨分化潜能的影响。结果:两种培养条件下PDLSC均表达干细胞表面标记物,并具有增殖和多向分化潜能,但相比于PDLSC,I-PDLSC的增殖、成脂和成骨分化能力明显减弱;成骨诱导早期,透射电镜观察两组细胞,均可见自噬特征性结构;相比于PDLSC,I-PDLSC成骨诱导过程中的自噬和自噬流水平受到抑制;成骨诱导中,低剂量的自噬激动剂（雷帕霉素）处理可激活I-PDLSC自噬,并改善其成骨分化潜能;反之,自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤）处理抑制PDLSC的自噬和成骨分化潜能。结论:炎性环境抑制PDLSC的成骨分化潜能,并抑制PDLSC成骨诱导中的自噬和自噬流水平;自噬的调控影响正常和炎性培养条件下PDLSC的成骨分化潜能。以上结果表明炎性环境下PDLSC的自噬与其成骨分化潜能密切相关。第二部分炎性环境影响PDLSC成骨分化潜能的自噬-溶酶体机制研究目的:基于第一部分研究结果,进一步探索炎性环境影响PDLSC成骨分化潜能的具体机制,检测炎性环境对PDLSC成骨诱导中自噬-溶酶体机制的影响。方法:通过免疫荧光检测炎性环境对PDLSC成骨诱导中LC3蛋白水平的影响;Western blot检测调控自噬-溶酶体系统的转录因子EB（TFEB）在I-PDLSC的表达水平,q-PCR检测I-PDLSC的自噬/溶酶体相关基因的表达水平;LC3和LAMP1免疫荧光共定位检测I-PDLSC的自噬小体和溶酶体融合情况;LAMP1蛋白的Western blot、流式细胞术和免疫荧光检测炎性环境对PDLSC溶酶体数量的影响;p62蛋白免疫荧光检测炎性环境对PDLSC溶酶体降解功能的影响;Lyso Tracker Red探针检测炎性环境对PDLSC溶酶体体积的影响。结果:相比于PDLSC,成骨诱导中I-PDLSC表达的总LC3增多、自噬流水平的LC3减少;I-PDLSC胞核内表达的TFEB蛋白水平较PDLSC低;与此同时,I-PDLSC相比于PDLSC表达的自噬相关基因MAP1LC3B、BECN1和溶酶体相关基因HEXA水平下降,自噬相关基因SQSTM1水平上升;相比于PDLSC,I-PDLSC的LC3和LAMP1的共定位比例下降,细胞内溶酶体数量减少,而I-PDLSC的溶酶体体积增大,大小不均一;相比于PDLSC,I-PDLSC表达的p62蛋白水平上升,且添加自噬抑制剂Baf前后,I-PDLSC表达的p62蛋白水平差异较PDLSC小。结论:炎性环境抑制PDLSC表达调控自噬-溶酶体系统的TFEB,和自噬-溶酶体系统的功能相关的基因。此外,炎性环境抑制PDLSC的自噬小体和溶酶体的融合;并且,炎性环境下PDLSC的溶酶体数量减少,体积增大,降解功能下降。以上结果表明炎性环境通过导致自噬-溶酶体系统的功能紊乱造成PDLSC成骨分化潜能下降。第三部分金纳米颗粒通过自噬-溶酶体机制影响炎性环境中PDLSC成骨分化目的:研究Au NP对炎性环境下PDLSC的成骨分化潜能和成骨诱导中自噬和自噬流水平的影响;分析自噬在Au NP影响炎性环境下PDLSC成骨分化的作用;进一步探索Au NP调控炎性环境下PDLSC成骨分化的机制。方法:活/死细胞染色、CCK-8和茜素红染色检测不同粒径/浓度Au NP对I-PDLSC的生物相容性、增殖和成骨分化潜能的影响;Western blot进一步筛选Au NP的浓度对I-PDLSC的成骨分化潜能的影响;透射电镜观察Au NP作用的I-PDLSC的自噬特征性结构和Au NP在I-PDLSC内的定位情况;Western blot检测Au NP对I-PDLSC自噬和自噬流水平的影响;LC3免疫荧光、mRFP-GFP-LC3腺病毒进一步检测Au NP对I-PDLSC自噬流水平的影响;Western blot和茜素红染色检测自噬的抑制对Au NP作用的I-PDLSC成骨分化潜能的影响;机制研究中,Western blot检测Au NP对IPDLSC的TFEB表达水平的影响,q-PCR检测Au NP对I-PDLSC自噬/溶酶体相关基因表达水平的影响;LC3和LAMP1免疫荧光共定位检测Au NP对I-PDLSC的自噬小体和溶酶体融合情况;LAMP1流式细胞术和免疫荧光检测Au NP对I-PDLSC的溶酶体数量的影响;p62免疫荧光检测Au NP对I-PDLSC溶酶体降解功能的影响;Lyso Tracker Red探针检测Au NP对I-PDLSC的溶酶体体积的影响。结果:5 nm、20 nm、40 nm粒径的Au NP均具有良好的生物相容性,且不影响IPDLSC的细胞增殖,其中,40 nm粒径的Au NP最能促进I-PDLSC的成骨分化潜能;0.001 nM和0.01 nM浓度的Au NP不影响I-PDLSC的细胞增殖,并促进其成骨分化潜能,并且此范围内,浓度越高的Au NP越能促进I-PDLSC的成骨分化和自噬水平;透射电镜可观察到在成骨诱导中,Au NP作用的I-PDLSC细胞内的自噬特征性结构,并且Au NP被包裹在自噬小体或自噬溶酶体等结构中;Au NP促进I-PDLSC的自噬和自噬流水平;但是,Au NP对I-PDLSC细胞内总LC3蛋白水平没有显著影响;自噬抑制剂抑制Au NP作用的I-PDLSC表达自噬相关蛋白,并抑制其成骨分化;Au NP促进I-PDLSC胞核内的TFEB表达,并促进自噬/溶酶体功能相关的基因表达;Au NP还促进I-PDLSC的自噬小体与溶酶体融合;Au NP对I-PDLSC的溶酶体数量没有显著影响,但是,Au NP在一定程度上减小I-PDLSC的溶酶体体积;Au NP抑制I-PDLSC表达p62蛋白,且添加Baf前后,其表达的p62蛋白水平差异增大。结论:不同粒径/浓度的Au NP对炎性环境下PDLSC的增殖和成骨分化能力的影响不同;Au NP能够促进炎性环境下PDLSC的自噬和自噬流水平;并且,Au NP促进炎性环境下PDLSC成骨分化与其调控成骨诱导中的细胞自噬有关。进一步的机制研究发现,Au NP能够促进炎性环境下PDLSC自噬-溶酶体系统相关的TFEB的激活和基因的表达,并促进自噬小体和溶酶体的融合过程;Au NP不影响炎性环境下PDLSC的溶酶体数量,但是,Au NP能够促进炎性环境下PDLSC的溶酶体降解功能,并在一定程度上减小其溶酶体体积。以上结果表明Au NP能够通过自噬-溶酶体机制促进炎性环境下PDLSC的成骨分化潜能。总结本课题围绕炎性环境对PDLSC成骨分化潜能的影响及其相关机制进行研究。我们发现炎性环境不仅削弱PDLSC成骨分化潜能,也对在成骨诱导中自噬水平产生影响;进一步通过细胞成骨诱导中自噬-溶酶体系统的功能变化研究,发现自噬-溶酶体机制在炎性环境影响PDLSC成骨分化中发挥的重要作用;Au NP可作为针对自噬-溶酶体机制的调控方式,改善炎性环境对PDLSC的不利影响。本课题首次发现自噬-溶酶体机制参与炎性环境抑制PDLSC成骨分化的过程,为炎性环境中牙周组织再生提供新的治疗靶点;并且首次发现Au NP对干细胞自噬-溶酶体系统的保护性调控作用,为炎性环境下干细胞命运提供新的调控策略。