目的:肺癌是第二常见癌症,是导致癌症死亡的主要原因。2020年,全球肺癌死亡人数高达180万例,远高于其他癌症。肺癌可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）两大类,其中NSCLC占肺癌总发生率的80-85%。待临床确诊时有34%为Ⅰ和Ⅱ期,28%为Ⅲ期,38%为Ⅳ期,在各临床分期NSCLC患者治疗中,放射治疗为其重要的局部治疗手段,约（64.3±4.7）%患者在治疗的不同时期需要接受放射治疗。然而,NSCLC放射治疗后仍有较高的局部区域复发率及远处转移率,目前认为,NSCLC对放射治疗的抵抗是导致这一结果的主要原因。肿瘤细胞对放射治疗产生抵抗性的机制是非常复杂的,目前研究表明,相关基因改变、肿瘤微环境、缺氧、代谢改变、肿瘤干细胞、肿瘤异质性、micro RNA、细胞周期以及DNA损伤和修复等多种因素导致肿瘤的放射抵抗。但NSCLC放射抵抗的具体分子机制仍不完全清楚。因此,研究肺癌放疗抵抗机制,并寻找有效的措施减少放疗抵抗,提高放疗敏感性是肺癌放射治疗中亟待解决的问题。研究方法:第一部分:基于课题组前期对NSCLC放射抵抗细胞系与其亲代细胞系测序结果,对差异表达m RNA进行进一步生物信息学分析。结合KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析,以及查阅文献,发现细胞粘附在放射抵抗中起到了重要的作用,因此对富集于粘附及相关通路的基因进行差异分析。运用STRING数据库对粘附相关差异表达基因进行蛋白互作网络图构建,Cytoscape软件筛选hub基因,在非小细胞肺癌中,对排名前十的hub基因进行表达及预后分析。第二部分:采用流式细胞术细胞凋亡和细胞克隆形成实验,对经10次传代后放射抵抗细胞系的抵抗性进行了重新验证。运用PCR（Polymerase chain reaction）及Western Blot对ITGB1差异表达进行验证。应用R语言对TCGA非小细胞肺癌患者进行ITGB1的肺癌组织中的表达以及其表达与临床相关性分析。采用PCR和Western Blot技术检测1株人支气管上皮细胞和5株非小细胞肺癌细胞系ITGB1m RNA和蛋白水平的表达情况。运用流式细胞术细胞凋亡和细胞克隆形成实验对A549和H522进行放射敏感性的探索。运用慢病毒技术构建H522 ITGB1稳定过表达细胞株以及A549与H460R ITGB1稳定敲除细胞株。应用CCK8和细胞克隆形成实验探索ITGB1对放射后各细胞系增殖及敏感性影响。运用流式细胞术细胞凋亡和细胞周期实验探索ITGB1对放射后各细胞系细胞凋亡和细胞周期的影响。应用免疫荧光技术以及Western Blot检测DNA损伤标志性指标γH2AX,探索ITGB1对放射后各细胞系DNA损伤的影响。采用STRING在线工具构建ITGB1与DNA损伤修复通路蛋白互作网络（Protein-Protein Interaction,PPI）分析,探索潜在的相互作用,并运用Western Blot技术进行了DNA损伤修复通路的检测。运用Western Blot实验检测过表达或敲除ITGB1后EMT相关指标E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin及Zeb1表达变化。使用GEPIA2中的“相关分析”,探索ITGB1与YAP1的Spearman相关系数;使用GEPAI2数据库中的“生存分析”,探索ITGB1与YAP1基因共表达对非小细胞肺癌患者总生存期和无病生存期的影响。运用Western Blot实验探索ITGB1对胞浆及胞核中YAP1蛋白表达,以及其总蛋白表达的影响。结果:第一部分:1.前期课题组成功建立NSCLC放射抵抗细胞系H460R,二代测序分析差异表达m RNA,与亲代细胞相比,抵抗细胞系H460R细胞中有508个m RNA上调,330个m RNA下调。KEGG通路富集分析发现主要富集于细胞粘附相关通路:细胞外基质-受体相互作用通路,焦点粘附及细胞粘附分子信号通路。2.STRING及Cytoscape筛选出Hub基因:ITGB1、ITGA1、ITGB4、ITGA3、ITGA2、LAMA5、COL4A5、LAMB1、LAMA1和COL4A6,排名第一的Hub基因ITGB1在非小细胞肺癌中表达升高,且其表达与预后相关,将对其进行后续研究。第二部分:1.对来自TCGA的NSCLC数据集（1,102例,包括103个正常组织和999个肿瘤组织）的分析显示,ITGB1在NSCLC中高表达,ITGB1表达与临床分期,T分类和M分类显著相关。通过敏感性验证,经过10代后,抵抗细胞系仍能够维持其放射抵抗性,q RT-PCR及Western Blot检测结果证实,与亲代细胞系相比,ITGB1在抵抗细胞系呈高表达。2.ITGB1在各非小细胞肺癌细胞系中不同程度表达,选取ITGB1本体高表达A549和本体低表达H522细胞系进行后续实验,与H522细胞相比,A549细胞照射后的凋亡率更低,集落形成能力及存活率更高。3.我们应用慢病毒构建了A549-sh ITGB1和H460R-sh ITGB1稳定敲除细胞系,构建了H522-ITGB1稳定过表达细胞系,照射后,A549-sh ITGB1和H460R-sh ITGB1的存活率比对照组低,H522-ITGB1细胞的存活率高于对照组。4.流式细胞仪的细胞凋亡分析表明,照射后48h,A549-sh ITGB1和H460R-sh ITGB1组的凋亡细胞比例明显高于对照组,相反,H522-ITGB1细胞中放射线诱导的凋亡发生率明显低于阴性对照细胞,流式细胞术评估细胞周期分布,与阴性对照相比,照射后24h,A549-sh ITGB1和H460R-sh ITGB1细胞中G2/M期的细胞比例较高,而S期中的比例较低,G2/M期的H522-ITGB1细胞比例显著低于阴性对照组,而S期的比例较高。5.我们进行了免疫荧光检测,以检测照射后或未照射时γH2AX的表达,与未照射的细胞相比,A549-sh ITGB1和对照细胞在照射后30分钟时的γH2AX阳性细胞核明显更多,但是,H522-ITGB1细胞阳性核数少于对照组,在两组中,γH2AX阳性细胞核的数量均随电离辐射时间的延长而减少,并在24 h后恢复至基础水平,我们通过蛋白质印迹检测了γH2AX蛋白水平进行了验证,与免疫荧光实验结果相一致。通过ITGB1与DNA损伤修复通路蛋白互作分析,ITGB1可能与ATM/CHK2通路有关,ITGB1沉默后ATM（p-ATM）、CHK2（p-CHK2）和CDC25c（p-CDC25c）的表达降低,而ITGB1的过表达导致这些蛋白在H522细胞中更高的表达。6.敲除ITGB1后,N-cadherin、Vimentin、Snail和Zeb1表达显著下调,E-cadherin表达上调,相反,ITGB1的过表达下调了H522细胞中E-cadherin的表达,并上调了N-cadherin、Vimentin、Snail和Zeb1的表达。7.我们使用GEPIA2研究了LUAD、LUSC和正常组织样品中ITGB1和YAP1之间表达的相关性,在LUAD（Cor=0.37,P<0.01）和LUSC（Cor=0.41,P<0.01）样本中,ITGB1表达与YAP1表达呈正相关。此外,GEPIA2中对NSCLC患者的生存分析表明,这两个基因共同高表达患者总体生存期及无病生存期显著缩短。蛋白质印迹分析显示,当在A549细胞中敲除ITGB1时,YAP1被下调,同时抑制其入核,而在H522-ITGB1组中,YAP1的表达被上调,且细胞核YAP1中表达显著增加。结论:1.二代测序方法筛选出放射抵抗细胞系与亲代细胞系差异表达的m RNA,基于KEGG通路富集分析,进行了深入的挖掘,为后续放射抵抗机制研究提供了有利的线索。2.粘附相关通路对NSCLC细胞放射抵抗的形成具有重要作用,ITGB1是粘附相关通路中关键基因,ITGB1高表达与临床病理特征、预后及放射抵抗形成相关。3.沉默ITGB1可能通过抑制NSCLC细胞DNA修复能力,调节YAP1诱导的EMT,进而逆转NSCLC放射抵抗。