研究目的:支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的慢性呼吸道疾病,其临床症状包括呼吸困难、胸闷、喘息和咳嗽。目前全球约有3.34亿人患哮喘,且有证据表明其发病率逐年上升,哮喘已成为重要的公共卫生问题。哮喘一般起始于抗原呈递细胞和支气管上皮细胞的失常。已有研究表明支气管上皮损伤是哮喘发病机制的重要组成部分,且与疾病的严重程度密切相关。随着哮喘的发展,在变应原的刺激下,支气管上皮细胞发生异常凋亡。据报道,严重哮喘患者上皮细胞的凋亡率增加。而凋亡细胞的清除延迟或缺陷能够加重气道炎症和气道高反应性。在哮喘中,机体的氧化和抗氧化失衡引起了氧化应激,它能够激活炎症信号和支气管上皮细胞的凋亡。然而目前在哮喘中支气管上皮细胞的凋亡和氧化应激机制尚不清楚。为探究可能的发病机制,我们在GEO数据库中选取了哮喘相关数据集,发现基因果糖-1,6-二磷酸酶（Fbp1）在哮喘中高表达。Fbp1是糖异生的限速酶,能够催化1,6-二磷酸果糖分解为6-磷酸果糖和无机磷酸盐。研究表明Fbp1在多种疾病中起着重要作用,包括2型糖尿病、癌症和急性肝衰竭。在二型糖尿病中,Fbp1可能是其潜在的治疗靶点。在胆管癌细胞中,Fbp1的过表达能够诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖与迁移。Fbp1的缺失也抑制了乳腺癌中活性氧的产生。同时,Fbp1被认为是一种很有前景的急性肝衰竭生物标志物,其表达水平与疾病严重程度相关。然而,Fbp1在呼吸道疾病如哮喘中的表达及作用尚不清楚。研究表明核转录因子E2相关因子（Nrf2）是一种重要的内源性抗氧化和抗凋亡的转录因子。在哮喘中Nrf2信号通路被认为是重要的保护机制,在维持支气管上皮完整性中发挥了重要的作用。Nrf2激活剂已被证明能够改善哮喘小鼠的气道炎症、气道高反应性及上皮细胞氧化应激等。然而,尚未有研究报道Fbp1与Nrf2信号通路之间的关系。基于以上,本课题拟从生信数据中发现及总结Fbp1对于哮喘的研究价值。同时,在动物和细胞实验中进一步探讨Fbp1在哮喘中的表达及定位,探讨Fbp1是否影响气道上皮细胞氧化应激与凋亡。最后明确Fbp1影响气道上皮氧化应激及凋亡的潜在机制。研究方法:一、选取公共数据库中哮喘相关数据集,建立哮喘动物模型及体外实验模型,分析Fbp1在模型中的表达水平。1、哮喘相关数据集选取。在公共数据库GEO中选取卵蛋白诱导的哮喘小鼠相关数据集 GSE41667、GSE6858、GSE41665 与 GSE79156,选取 IL-4 或 IL-13 刺激支气管上皮细胞相关数据集GSE19182、GSE37693与GSE78914,由于GSE19182数据集中同时包含IL-4与IL-13两种处理因素刺激支气管上皮细胞,因此可以将GSE19182视为两个数据集。用R语言进行数据质量监督,用R语言结合GEO2R的方法进行数据处理,将数据集中基因表达情况绘制成火山图。同时我们在已发表的文章中寻找到另一卵蛋白诱导的哮喘小鼠差异基因的数据集。2、用UpsetR数据包对以上9个数据集取交集,分析核心基因。同时分析Fbp1在每个数据集中的表达情况。3、哮喘小鼠模型的建立。16只Balb/c小鼠分为2组:（1）生理盐水对照组（2）OVA哮喘组。在哮喘组中,在实验的第0、7、14天予小鼠腹腔注射50 μg OVA与0.8 mg氢氧化铝凝胶联合致敏,第21-27天予小鼠2%OVA每日雾化激发30分钟。在对照组中,用生理盐水代替OVA对小鼠进行致敏和激发。4、收集哮喘小鼠的肺泡灌洗液,对肺泡灌洗液中的白细胞进行总数计数与分类计数。5、收集哮喘小鼠的肺组织标本进行HE染色与PAS染色,观察气道炎症及黏液分泌情况。6、使用免疫组化方法检测哮喘小鼠肺组织气道上皮细胞中Fbp1的表达情况,使用Western blot及qPCR方法分别检测哮喘小鼠肺组织中Fbp1的蛋白与mRNA表达水平。7、用IL-4或IL-13刺激支气管上皮细胞16HBE与Beas-2B,Westernblot方法检测IL-4或IL-13刺激的16HBE及Beas-2B中p-Stat6、Stat6及Fbp1的蛋白表达水平。二、研究Fbp1对支气管上皮细胞氧化应激及凋亡的影响。1、在16HBE与Beas-2B细胞中,过表达及敲减Fbp1,通过碘化丙啶DNA流式细胞染色法及Annexin VPE/7AAD流式细胞术检测细胞周期与凋亡的变化,明确Fbp1是否能够影响细胞的周期比例及凋亡百分比。Western Blot方法检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3及caspase-3的表达水平,明确Fbp1是否能够影响细胞中凋亡指标的变化。2、在16HBE与Beas-2B细胞中,过表达及敲减Fbp1,通过2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）探针检测细胞中活性氧自由基（ROS）的含量,通过MDA、GSH、SOD试剂盒检测细胞中MDA、GSH的含量、SOD的活性。三、Fbp1加重气道上皮细胞氧化应激诱导的凋亡的机制研究。1、在16HBE及Beas-2B细胞中过表达及敲减Fbp1,通过Western Blot检测核Nrf2、Keap1、总Nrf2、HO-1的蛋白表达水平,明确Fbp1是否影响Nrf2通路的激活。2、在16HBE及Beas-2B细胞中,在敲减Fbp1的同时加入Nrf2抑制剂ML385,Annexin V PE/7AAD流式细胞术检测细胞凋亡变化。Western Blot方法检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3及caspase-3的蛋白表达水平,明确Fbp1影响凋亡是否部分依赖于Nrf2通路。3、在16HBE及Beas-2B中,在敲减Fbp1的同时加入Nrf2抑制剂ML385,通过2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）探针检测细胞中活性氧自由基的含量,明确Fbp1影响氧化应激是否部分依赖于Nrf2通路。研究结果:一、Fbp1在哮喘小鼠肺组织支气管上皮细胞、IL-4或IL-13诱导的支气管上皮细胞中的表达增多。1、卵蛋白诱导的哮喘小鼠模型相关的数据集GSE41667、GSE6858、GSE41665与GSE79156,IL-4或IL-13刺激的支气管上皮细胞相关的数据集GSE19182、GSE37693与GSE78914的质量均合格,可以纳入分析。R语言结合GE02R分析数据集中基因的表达差异,将高表达的基因取交集后,我们发现只有基因Fbp1同时高表达在9个数据集中。2、哮喘小鼠模型中,肺泡灌洗液白细胞数量增多,且以嗜酸性粒细胞为主。病理可见气管及血管旁有大量的炎症细胞浸润,气道杯状细胞增生,黏液高分泌。3、哮喘小鼠肺组织中Fbp1蛋白表达水平及mRNA表达水平均高于对照组。肺组织免疫组化结果发现,支气管上皮细胞中的Fbp1表达增高。4、经IL-4或IL-13处理16HBE细胞及Beas-2B细胞,p-Stat6蛋白表达水平显著升高,证明IL-4及IL-13具有生物学活性。IL-4或IL-13处理48小时后,16HBE与Beas-2B细胞中的Fbp1表达升高。二、在支气管上皮细胞中,Fbp1能够加重氧化应激诱导的细胞凋亡。1、在16HBE细胞及Beas-2B细胞中,转染Fbp1 siRNA1及siRNA2能够降低细胞中Fbp1的蛋白表达水平,转染Fbp1质粒能够显著上调Fbp1的表达水平。碘化丙啶DNA流式细胞染色法结果显示,敲减Fbp1后细胞G2/M 比例减少,过表达Fbp1后,细胞G2/M 比例增多。AnnexinVPE/7AAD流式细胞术结果显示,敲减Fbp1后细胞凋亡下降,过表达Fbp1后细胞凋亡增多。Western Blot结果同样也显示,在敲减Fbp1后细胞中Bax、cleaved-caspase-3表达水平下降,Bcl-2表达水平上升、caspase-3表达没有变化;过表达Fbp1后细胞中Bax、cleaved-caspase-3表达水平上升,Bcl-2表达水平下降、caspase-3表达没有变化。2、在16HBE细胞及Beas-2B细胞中,敲减Fbp1后细胞中ROS的含量下降,过表达Fbp1后细胞中ROS的含量增多;同样的,敲减Fbp1后细胞中脂质过氧化标志物MDA减少,抗氧化标志物SOD及GSH增多,过表达Fbp1后细胞中MDA增多,SOD及GSH减少。三、Fbp1通过调控Nrf2信号通路加重氧化应激诱导的细胞凋亡的机制研究。1、在16HBE及Beas-2B细胞中,Westernblot结果表明敲减Fbp1后,核-Nrf2、总Nrf2、HO-1的表达量增多,Keap1的表达量减少;而过表达Fbp1后,核-Nrf2、总Nrf2及HO-1的表达量减少,Keap1的表达量增多。2、在16HBE及Beas-2B细胞中,Western blot结果表明加入Nrf2抑制剂ML385后,总Nrf2的蛋白表达减少。Annexin V PE/7AAD流式细胞术结果表明,与单独敲减Fbp1组相比,在敲减Fbp1的同时加入ML385能够加重的凋亡,但比转染siRNA-NC组的凋亡率要小。Western Blot结果表明与单独敲减Fbp1组相比,敲减Fbp1的同时加入Nrf2抑制剂ML385组的Bax、cleaved-caspase-3的表达量增加,Bcl-2的表达量降低（除外在16HBE细胞中转染Fbp1 siRNA2组与转染Fbp1 siRNA2同时加入ML385组的比较）。3、在16HBE及Beas-2B细胞中,DCFH-DA探针检测结果表明,与单独敲减Fbp1组相比,敲减Fbp1同时加入ML385组的细胞活性氧自由基增多,但弱于转染小干扰对照组。研究结论:1、Fbp1在哮喘小鼠支气管上皮细胞及IL-4或IL-13刺激的支气管上皮细胞16HBE、Beas-2B细胞中高表达。2、在16HBE及Beas-2B细胞中,过表达Fbp1可以加重细胞凋亡及氧化应激;敲减Fbp1能够减缓细胞凋亡及氧化应激。3、Fbp1能够通过抑制Nrf2信号通路从而加重氧化应激诱导的细胞凋亡。Nrf2抑制剂能够部分回复Fbp1诱导的氧化应激与凋亡。