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研究目的人牙根尖乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs),是一种来源于正在发育的牙根尖乳头组织的间充质干细胞,在年轻恒牙的牙根发育中发挥重要作用。间充质干细胞具有免疫调控功能,那么SCAPs是否对免疫细胞有一定的调控作用,目前尚不清楚。单核巨噬细胞在免疫反应中发挥重要作用,被微生物及各种趋化因子活化可产生IL-6、TNF-a等炎性因子,从而导致炎症的发生、发展。根据巨噬细胞分泌的细胞因子和表型可将其分为两种极化类型,即促进炎症发生的Ml型巨噬细胞和促进组织修复的M2型巨噬细胞。有研究发现,间充质干细胞能够抑制单核巨噬细胞的活化并促进其向M2型极化从而达到免疫抑制的作用,本实验初步探讨SCAPs对单核巨噬细胞活化和极化的免疫调控作用。实验方法和结果1.细胞培养(1)SCAPs的培养:收集因正畸治疗需要而拔除的未发育完全的健康第三磨牙,无菌分离根尖乳头组织,采用酶消化法分离培养SCAPs。(2)单核细胞系THP-1、U937传代培养。(3)人单核细胞源性巨噬细胞(Monocyte-derived macrophages,MDM):淋巴细胞分离管分离健康人的外周血获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),将PBMC细胞悬液置培养皿中过夜,其中的单核细胞可贴壁成巨噬细胞。2.SCAPs促进单核细胞THP-1向M2样巨噬细胞极化SCAPs与THP-1通过Transwell小室进行共培养,实验组为SCAPs+THP-1;对照组为THP-1。qPCR结果显示实验组THP-1中与Ml型巨噬细胞相关的TNF-α和IL-12在共培养1d时升高,其余时间点均呈下降趋势(p0.5),与M2型巨噬细胞相关的IL-10、TGF-β1、CD163、CD206均升高(p<0.5),仅CD206在共培养3d时有下降趋势;流式细胞术检测共培养3d THP-1中TNF-α的表达情况,发现实验组的TNF-α表达显著下降(p<0.5),与qPCR结果一致;Western Blotting 检测共培养后 THP-1 中 stat3/P-stat3、smad3/P-smad3 的表达情况,发现实验组P-stat3/stat3蛋白相对表达水平较对照组呈上升趋势(p<0.5)而P-smad3/smad3蛋白相对表达水平则未见明显变化(p>0.5),表明SCAPs促进THP-1向M2样巨噬细胞极化,可能与stat3通路的激活有关。3.SCAPs抑制PMA诱导的巨噬细胞中TNF-a的表达单核细胞系 THP-1、U937 通过佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导成巨噬细胞后与SCAPs共培养,实验组为巨噬细胞+SCAPs;对照组为巨噬细胞。qPCR检测共培养后巨噬细胞样THP-1中炎性因子和表面标志物的表达情况,发现实验组TNF-α的表达显著下降(p<0.5),而与极化相关的其他分子则无明显变化,仅IL-10、CD163在共培养的初期较对照组升高(p<0.5),实验组巨噬细胞样U937中TNF-α的表达也显著下降(p<0.5)。通过ELISA检测共培养上清中的TNF-α的表达量,发现实验组上清中TNF-α的表达下降(p<0.5),进一步证实与SCAPs共培养后,巨噬细胞样THP-1和巨噬细胞样U937分泌的TNF-α降低,表明SCAPs对PMA诱导的巨噬细胞极化作用不明显,却对TNF-α抑制作用明显增强。4.SCAPs上清抑制人单核细胞源性巨噬细胞的活化PBMC中的单核细胞贴壁成巨噬细胞后弃上清,加适量的SCAPs条件培养液培养4d,实验组为SCAPs条件培养液+MDM;对照组为α-MEM培养液+MDM。通过qPCR检测MDM炎性因子表达情况,实验组TNF-α、IL-12、IL-6、IL-Iβ的表达均较对照组降低(p<0.5),而实验组IL-10、TGF-β1的表达无明显变化(p>0.5),说明SCAPs上清可以抑制MDM的活化。结论通过共培养,SCAPs可以促进单核细胞THP-1向M2样巨噬细胞极化,且stat3通路的激活可能参与其中;SCAPs对PMA诱导的巨噬细胞样THP-1的极化作用不明显,却可以显著抑制巨噬细胞样THP-1、U937中TNF-α的表达;SCAPs上清能够抑制人单核细胞源性巨噬细胞的活化。