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第一部分hsa-mir-125a在破骨细胞分化过程中的作用研究目的：研究hsa-mir-125a在破骨细胞分化过程中所发挥的作用方法：①体外培养CD14+PBMCs,用RANKL联合M-CSF诱导其向破骨细胞分化,提取诱导前和诱导后不同时间点的细胞总RNA,采用RT-PCR法检测分化过程中hsa-mir-125a的表达模式。②在miRBase数据库中获得hsa-mir-125a的前体序列pre-mir-125a,用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体合成hsa-mir-125a的表达载体pre-mir-125a,同时合成2’甲氧基修饰的hsa-mir-125a反义miRNA(anti-mir-125a),并将pre-mir-125a、anti-mir-125a或其各自的阴性对照载体(miR-C)分别转染CD14+PBMCs,转染后加入RANKL和M-CSF共同诱导细胞分化。③转染诱导后,用RT-PCR法检测细胞中hsa-mir-125a表达水平的变化。④在转染诱导后第6天,提取细胞总RNA,检测破骨细胞特异性标记TRAP、NFATc1的mRNA水平,同时收集细胞行TRAP染色实验观察破骨细胞分化情况。结果：①在诱导CD14+PBMCs向破骨细胞分化过程中,随着诱导时间的延长,hsa-mir-125a的表达逐渐减少。②使用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR成功构建了hsa-mir-125a的表达载体pre-mir-125a,其转染的CD14+PBMCs能在细胞中高表达hsa-mir-125a。③hsa-mir-125a高表达能降低破骨细胞分化特异性指标TRAP、 NFATc1的mRNA水平,减少TRAP阳性多核巨细胞的形成；而抑制hsa-mir-125a的表达后,TRAP、NFATc1的mRNA水平相应提高,TRAP染色阳性的多核巨细胞形成也较对照组明显增加。结论：hsa-mir-125a在破骨细胞分化过程中表达逐渐降低。过表达hsa-mir-125a可以抑制破骨细胞分化,而阻遏hsa-mir-125a的表达则促进破骨细胞分化。第二部分hsa-mir-125a调控破骨细胞分化的机制研究目的：寻找hsa-mir-125a在破骨细胞分化过程中作用的靶基因,探究hsa-mir-125a与其靶基因在调控破骨细胞分化过程中的相互作用机制。方法：①利用三种常用的靶基因预测软件预测hsa-mir-125a可能作用的靶基因,结合hsa-mir-125a在破骨细胞分化过程中的功能,在预测结果交集中筛选出TRAF6基因为潜在的靶基因。②根据hsa-mir-125a在TRAF6基因3UTR结合位点的碱基序列构建野生型荧光素酶报告载体WT-pGL3-TRAF6-3’UTR和突变型荧光素酶报告载体MUT-pGL3-TRAF6-3’UTR。将这两个载体分别与pre-mir-125a或对照载体(miR-C)交叉共转染CD14+PBMCs后,检测载体的荧光素酶活性变化,验证TRAF6确为hsa-mir-125a作用的靶基因。③用pre-mir-125a单独转染CD14+PBMCs, RT-PCR和Western Blotting法分别检测TRAF6基因的mRNA和蛋白的表达水平变化。结果：①靶基因预测软件预测出TRAF6为hsa-mir-125a作用的靶基因。②交叉共转染细胞后检测荧光素酶活性,pre-mir-125a和WT-pGL3-TRAF6-3’UTR共转染组的荧光素酶报告基因活性明显受到抑制,而pre-mir-125a和MUT-pGL3-TRAF6-3’UTR共转染组、miR-C和MUT-pGL3-TRAF6-3’UTR共转染组的荧光素酶报告基因活性均无明显变化。③单独转染pre-mir-125a可以抑制TRAF6蛋白表达水平,而对TRAF6mRNA水平无影响。结论：通过靶基因软件预测和双荧光素酶报告基因实验证实的方法确定了TRAF6为hsa-mir-125a作用的靶基因。hsa-mir-125a可在转录后水平抑制TRAF6表达,从而抑制破骨细胞分化。