目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种临床常见的慢性自身免疫性炎性疾病,以累及周围关节为主,亦可侵袭心血管等关节外脏器组织。近年来,RA心血管并发症的发生率与死亡率呈不断上升的趋势。RA的心血管损害以动脉粥样硬化为主,而血管内皮功能障碍被认为是启动动脉粥样硬化进程的第一步,与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。为此,进一步探讨RA血管内皮功能障碍及其发生机制,保护内皮功能,成为改善RA预后的主要研究目标之一,具有重要的临床意义。本课题拟通过建立佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis, AA)大鼠模型,研究清心饮对佐剂性关节炎大鼠离体血管内皮依赖性舒张功能的作用,并分析其对模型大鼠血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)、脂联素(adiponectin, APN)水平,血浆N末端-前脑利钠肽(NT-proBNP)、内皮素-1(endothelin-1, ET-1)水平,以及胸主动脉内皮素-1(endothelin-1, ET-1)与MIF蛋白表达的影响,探讨由清热解毒类抗蛇毒中药组成的清心饮对血管内皮的保护机制,为临床预防和治疗RA动脉粥样硬化提供实验依据。方法:选择体重150-180g(喂食适应性饲料3天后)的Wistar大鼠,雌雄各半。测量双侧足爪厚度及容积后,于右后足跖底部常规消毒,皮内注射完全弗氏佐剂(0.1ml/只)建立AA大鼠模型。其中8只大鼠用相同方法注入等量生理盐水。每周测量关节炎指数(Arthritis Index,AI);造模后第19天将出现二次反应且AI值大于5的大鼠随机分成模型组、甲氨蝶呤组(MTX)、清心饮组(QXY)、甲氨蝶呤联合清心饮组(MTX+QXY),每组8只,注射生理盐水大鼠为空白对照组。当日测量大鼠体重,用自制容积测量仪测量各组大鼠足爪容积,游标卡尺测量各组大鼠足爪厚度。各治疗组连续灌胃给药21天(模型组灌胃给予等量生理盐水);于给药结束后第2天测量各组大鼠体重、足爪厚度及容积,4%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,分别留取血清、血浆,-70℃低温冰箱保存备检。取血后立即打开胸腔,取出胸主动脉,置于通入95%氧气和5%二氧化碳、PH为7.4±0.05的克氏液中,分离并去除血管周围脂肪及结缔组织,保留血管内皮,截取3-4mm的血管环,主动脉环浴皿法检测内皮依赖性舒张功能;剩余部分主动脉固定、脱水、包埋进行HE染色,免疫组织化学法测定胸主动脉ET-1及MIF表达,并进行半定量分析。采用放射免疫法测定血清TNF-α、IL-1β及血浆ET-1水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血浆NT-proBNP、血清脂联素及血清MIF含量。所有数据均采用SPSS for windows 13.0软件包进行统计学处理。计量资料正态分布数据用均数±标准差(±s)表示,自然对数转换后仍为非正态分布数据者用中位数(median)表示。各组间两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)或非参数检验(Nonparametric test)。方差分析前进行方差齐性检验,采用LSD法进行组间两两比较。相关性分析采用Pearson相关检验,P<0.05认为有统计学意义。结果:1. QXY对AA大鼠一般情况的影响与模型组相比,甲氨蝶呤组(MTX)、清心饮组(QXY)、甲氨蝶呤联合清心饮组(MTX+QXY)一般情况均有所改善。造模前各组大鼠体重(g)分别为空白组165.25±8.40、模型组164.75±10.55、QXY组164.50±7.05、MTX组166.13±6.24、联合组166.13±8.46;各组间体重相比无统计学差异(P>0.05)。造模后第19天,各组大鼠体重(g)分别为空白组215.25±14.73、模型组190.50±9.21、QXY组194.50±16.43、MTX组193.00±13.40、联合组194.88±15.91;模型组、MTX组、QXY组、联合组大鼠体重明显低于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);但模型组、MTX组、QXY组、联合组组间体重比较无明显统计学差异(P>0.05)。给药3周后,各组大鼠体重(g)分别为空白组277.88±19.78、模型组217.38±14.48、QXY组228.25±24.31、MTX组234.63±12.59、联合组247.38±16.47;模型组、MTX组、QXY组、联合组的大鼠体重低于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01)。模型组、QXY组和MTX组组间相比无统计学差异(P>0.05);但联合组体重明显高于模型组,差异具有显著性(P<0.01)。灌胃前后体重增加量相比较,MTX组、QXY组、模型组体重增加值低于空白对照组(P<0.05、P<0.01);模型组体重增加低于MTX组、联合组(P<0.05、P<0.01);但QXY组体重增加与模型组、MTX组相比,联合组体重增加与正常组相比,均无统计学差异(P>0.05)。2. QXY对AA大鼠足爪肿胀的抑制作用及关节炎指数的改善作用灌胃完毕后造模侧(右足)平均肿胀率(%)分别为:模型组89.44±6.11、QXY组80.62±5.96、MTX组67.38±11.49、联合组55.58±9.14;MTX组、QXY组、联合组右足肿胀率明显低于模型组(P<0.05、P<0.01);与MTX组、QXY组相比,联合组对造模侧足爪肿胀的抑制率较好,差异具有显著性(P<0.01);MTX组与QXY组相比,MTX右足肿胀率低于QXY组,差异具有显著性(P<0.01)。灌胃完毕后非造模侧(左足)平均肿胀度(%)分别为:模型组70.09±5.11、QXY组59.02±4.90、MTX组51.55±10.14、联合组40.58±5.25;MTX组、QXY组、联合组左足肿胀率明显低于模型组,差异具有显著性(P<0.01)。与MTX组、QXY组相比,联合组对非造模侧足爪肿胀的抑制率较好,差异具有显著性(P<0.01)。MTX组与QXY组相比,MTX左足肿胀率低于QXY组,差异具有统计学意义(P<0.05)。随着造模时间的延长,除空白对照组,各组大鼠关节红肿逐渐加重,关节炎指数逐渐增高。给药前各组大鼠关节指数分别为模型组10.63±2.07、QXY组11.75±3.85、MTX组10.38±2.92、联合组11.88±3.04;各组间相比无统计学差异(P>0.05)。灌胃3周后,各组大鼠关节炎指数分别为模型组10.75±1.58、QXY组8.88±2.47、MTX组7.38±3.16、联合组6.50±2.51;MTX组、联合组关节炎指数明显低于模型组(P<0.05、P<0.01);QXY组关节炎指数高于MTX组(P<0.05);而QXY组关节炎指数虽低于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。3. QXY对AA大鼠离体胸主动脉内皮依赖性舒张功能的影响各组大鼠对不同浓度(10-8mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L)乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张作用的反应如下:模型组、MTX组、QXY组、联合组舒张率(%)明显低于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组、QXY组舒张率明显高于模型组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组、QXY组低于联合组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组与QXY组相比,MTX组舒张率显著高于QXY组(P<0.05或P<0.01)。4. QXY对AA大鼠血清TNF-α、IL-1β、MIF、APN的影响4.1血清TNF-α、IL-1β水平比较各组大鼠血清TNF-α含量(ng/ml)分别为空白组1.043±0.117、模型组3.307±0.203、QXY组2.686±0.122、MTX组2.444±0.140、联合组1.183±0.089;模型组、MTX组、QXY组血清TNF-α水平明显高于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);联合组与空白对照组相比,无统计学差异(P>0.05);MTX组、QXY组、联合组明显高于模型组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组、QXY组大鼠血清TNF-α平均含量低于联合组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组与QXY组相比,MTX组大鼠血清TNF-α平均含量低于QXY组,差异具有显著性(P<0.01)。各组大鼠血清IL-1β含量(ng/ml)分别为空白组0.101±0.008、模型组0.346±0.025、QXY组0.257±0.016、MTX组0.240±0.014、联合组0.116±0.016;模型组、MTX组、QXY组血清IL-1β水平明显高于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);联合组与空白对照组相比,无统计学差异(P>0.05);MTX组、QXY组、联合组明显高于模型组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组、QXY组大鼠血清IL-1β平均含量低于联合组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组与QXY组相比,MTX组大鼠血清IL-1β平均含量低于QXY组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.2血清MIF水平比较各组大鼠血清MIF含量(ng/ml)分别为空白组3.597±0.626、模型组8.291±0.858、QXY组6.390±0.463、MTX组5.379±0.458、联合组4.155±0.556;模型组、MTX组、QXY组血清MIF水平明显高于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);联合组与空白对照组相比,无统计学差异(P>0.05);MTX组、QXY组、联合组低于模型组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组、QXY组高于联合组,差异具有统计学意义(P<0.05和P<0.01);QXY组血清MIF含量高于MTX组,差异具有显著性(P<0.01)。4.3血清APN水平比较各组大鼠血清APN水平(ug/ml)分别为空白组4.074±0.427、模型组2.161±0.347、QXY组2.678±0.223、MTX组2.383±0.396、联合组3.107±0.296;模型组、MTX组、QXY组血清APN水平明显低于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);QXY组、联合组高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05和P<0.01);MTX组低于联合组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组和QXY组、模型组相比,QXY组和联合组相比,血清APN水平无统计学差异(P>0.05)。5. QXY对AA大鼠血浆ET-1、NT-proBNP的影响5.1血浆ET-1水平(自然对数转换后)比较血浆ET-1含量(pg/m)各组分别为空白组3.980±0.064、模型组4.509±0.051、QXY组4.203±0.980 , MTX组4.195±0.111、联合组4.084±0.066;模型组、MTX组、QXY组及联合组ET-1水平明显高于空白对照组(P<0.05和P<0.01);正常组、MTX组、QXY组、联合组ET-1水平明显低于模型组,差异具有显著性(P<0.01);而MTX组、QXY组明显高于联合组,差异具有统计学意义(P<0.05);MTX组和QXY组相比,ET-1水平无统计学差异(P>0.05)。5.2血浆NT-proBNP水平比较血浆NT-proBNP含量(pg/m)各组分别为空白组61.36±4.63、模型组109.10±4.16、QXY组75.53±3.93、MTX组74.43±5.95、联合组68.57±3.36;模型组、MTX组、QXY组、联合组血浆NT-proBNP水平明显高于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组、QXY组、联合组血浆NT-proBNP水平明显低于模型,差异具有显著性(P<0.01);MTX组、QXY组高于联合组,差异具有统计学意义(P<0.05和P<0.05);MTX组和QXY组相比,血浆NT-proBNP水平无统计学差异(P>0.05)。6. AA大鼠离体胸主动脉HE染色及ET-1和MIF的表达6.1苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察:空白对照组大鼠动脉壁三层结构完整,内皮细胞无增生脱落,内膜内无泡沫细胞、淋巴细胞聚集,未见平滑肌及胶原纤维增生。模型组见主动脉内膜表面多处不光滑,内皮细胞间连接遭破坏,部分隆起、脱落,形成纵嵴低平;平滑肌可见空泡变及水肿。QXY组、MTX组及联合组可见不同程度的修复状态,尤以联合组改善明显。6.2用PV法染色后光镜下观察MIF和ET-1表达:正常大鼠胸主动脉内皮细胞MIF和ET-1未见明显表达;模型组内皮细胞和平滑肌细胞可见大量表达;MTX和QXY组内皮细胞和平滑肌细胞可见较强表达;联合组可见少量表达;半定量分析结果如下:MIF半定量分析:各组分别为空白组3.11±0.98、模型组43.01±14.03、QXY组31.41±11.48、MTX组20.59±9.62、联合组10.13±4.84;模型组、MTX组、QXY组明显高于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);联合组与空白对照组相比,无统计学差异(P>0.05);MTX组、QXY组、联合组明显低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.01和P<0.05);MTX组、QXY组平均含量低于联合组,差异具有统计学意义(P<0.01和P<0.05);MTX组与QXY组相比,MTX组低于QXY组,差异具有显著性(P<0.05)。ET-1半定量分析:各组分别为空白组7.37±2.11、模型组65.10±8.13、QXY组37.20±7.31、MTX组43.27±7.95、联合组14.14±6.75;模型组、MTX组、QXY组ET-1水平明显高于空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);MTX组、QXY组、联合组ET-1水平明显低于模型组,差异具有显著性(P<0.01);而MTX组、QXY组明显高于联合组,差异具有统计学意义(P<0.05);空白对照组和联合组相比,MTX组和QXY组相比,ET-1水平无统计学差异(P>0.05)。结论:1. AA大鼠存在血管内皮损伤和早期动脉粥样硬化的相关因素。2. MIF及NT-proBNP可能参与AA大鼠血管内皮损伤的病理过程;而APN则是血管内皮损伤的保护性因子之一;三者均可作为AA大鼠早期动脉粥样硬化的预测因素。3.清心饮可明显抑制AA大鼠关节炎指数,降低血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β水平;清心饮与MTX配伍则可显著增强上述抗炎作用。4.清心饮对AA大鼠血管内皮损伤具有显著保护效应,其部分作用机制包括:下调血液和胸主动脉ET-1、MIF表达;降低血清TNF-α、IL-1β和血浆NT-proBNP水平;提高血清APN含量等。