第一章 绪论2008年夏发生的三聚氰胺毒奶粉事件是我国食品安全的一次灾难性的事件。尽管三聚氰胺毒奶粉事件已过去4年,但三聚氰胺如何引发患儿这种特殊尿路结石的机制仍未彻底阐明；除三聚氰胺外,结石的形成是否还涉及其他因素至今尚不清楚。根据动物实验,三聚氰胺不仅可引发的泌尿系结石,而且还可能导致慢性肾损伤和膀胱癌。那么,在将来这些结石患儿这些病患风险程度所知甚少,以及这些风险是否可控目前无人研究。对此,本论文将研究三聚氰胺引发婴幼儿泌尿系结石的形成机制,特别是这种特殊结石的形成是否涉及三聚氰胺之外的因素；三聚氰胺本身对肾脏和膀胱器官细胞的毒性作用；三聚氰胺引发肾损伤及膀胱癌的病变特征,特别是膀胱癌及相应的防治措施。头孢曲松泌尿系结石的临床报道非常罕见,但近期我院于1月内连续收到2例头孢曲松钠引发的儿童尿路结石。这使我们产生了对头孢曲松钠药品安全性的担心。对此,我们立即对该类结石的理化性质进行分析,以及通过体外实验的方法初步探讨了该类结石形成的风险因素。由于头孢曲松钠与三聚氰胺均属于促进结石形成的外源性化合物,本课题也将附上这一章节。第二章 三聚氰胺结石成分的检测方法第一节 三聚氰胺结石的红外光谱定性分析目的：利用红外光谱定性分析三聚氰胺引发的婴幼儿泌尿系结石的成分。方法：首先利用三聚氰胺、三聚氰酸及尿酸在水溶液中分别制备三聚氰胺-三聚氰酸沉淀和三聚氰胺-尿酸沉淀。然后通过红外光谱分别检测三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸、三聚氰胺-三聚氰酸混合物(1：1摩尔比混合)、三聚氰胺-尿酸混合物(1：1摩尔比混合)、三聚氰胺-三聚氰酸复合物、三聚氰胺-尿酸复合物、以及一例婴幼儿三聚氰胺结石样本。对以上样本红外光谱图的典型峰位进行分析和比较。结果：三聚氰胺-三聚氰酸混合物和三聚氰胺-尿酸混合物的红外光谱峰位基本是两种混合物中各自化合物红外光谱峰位的集合。三聚氰胺-三聚氰酸沉淀物和三聚氰胺-三聚氰酸沉淀物的红外光谱峰位与之不同,三聚氰胺的典型峰位在在这两种沉淀物的谱图中均消失。1例三聚氰胺引发的儿童尿路结石的红外光谱典型峰位与三聚氰胺-尿酸沉淀物的红外光谱典型峰位基本相似。结论：红外光谱定性分析表明,婴幼儿结石由尿酸和三聚氰胺组成,并且我们认为是以三聚氰胺-尿酸复合大分子形式存在。第二节 三聚氰胺结石的液相色谱定量分析目的：建立高效液相色谱法同时检测结石或尿液中中三聚氰胺、三聚氰胺及尿酸的方法,并测定三聚氰胺引发的婴幼儿泌尿系结石的成分。方法：采用Agilent 1100型高效液相色谱仪、Agilent HC-C 18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm)、Agilent Zorbax Entend-C18 (4.6×12.5 mm,5μm)保护柱、10mmol/l磷酸盐缓冲液(pH 7.5)流动相、200 nm检测波长及1.0 ml/min流速同时检测溶液中三聚氰胺、三聚氰酸及尿酸浓度。1例三聚氰胺引发的儿童泌尿系结石经预处理后,采用该法检测其成分。结果：三聚氰胺最低检测限为0.005 μg/ml,线性范围为0.05-50 μg/ml,相对标准差<10%,平均回收率>90%。三聚氰胺最低检测限为0.025 μg/ml,线性范围为0.1-50,相对标准差<10%,平均回收率>90%。尿酸最低检测限为0.025 μg/ml,线性范围为0.1-50 μg/ml,相对标准差<10%,平均回收率>90%。1例三聚氰胺结石主要含有尿酸和三聚氰胺成分,二者摩尔比为2.1：1,且占结石重量的89.6%。结论：高效液相色谱法可同时检测尿液中或结石中三聚氰胺、三聚氰胺及尿酸。该法方便、快捷及准确。三聚氰胺引发的儿童尿路结石的主要成分为尿酸和三聚氰胺成分,二者摩尔比为1：2.1。第三章 三聚氰胺对泌尿系细胞株损伤的研究目的：探讨三聚氰胺对肾脏近端小管上皮细胞、肾脏远端小管上皮细胞、及膀胱上皮细胞的损伤毒性和预防损伤的措施。方法：CCK-8法检测0、625、1250、2500及5000 μg/ml三聚氰胺干预人肾脏近端小管上皮细胞(HK-2)、犬肾脏远端小管上皮细胞(MDCK)及人膀胱上皮细胞(SV-HUC-1) 24 h后的细胞增殖率。TBA法、DCFH-DA法及Annexin V-FITC/PI法分别检测0、625、1250、2500及5000 μg/ml三聚氰胺干预HK-2、MDCK及SV-HUC-1细胞12h后,培养液丙二醛(MDA)水平、细胞内活性氧(ROS)水平及细胞凋亡率。一定浓度的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及甘露醇与2500 μg/ml三聚氰胺联合干预HK-2、MDCK及SV-HUC-1细胞24 h, CCK-8法检测检测相应的细胞增殖率。结果：三聚氰胺干预HK-2、MDCK及SV-HUC-1细胞24 h的半数致死浓度(LC50)分别为3817、3118和4101 μg/ml。2500及5000 μg/ml三聚氰胺干预HK-2、MDCK及SV-HUC-1细胞12h后,三种细胞培养液中MDA水平明显高于阴性对照组(P<0.05),三种细胞内的活性氧水平明显高于阴性对照组(P<0.05),三种细胞的凋亡率明显高于阴性对照组(P<0.05)。对比2500 μg/ml三聚氰胺干预HK-2、MDCK及SV-HUC-1细胞的24 h增殖率,联合CAT及甘露醇干预后三种细胞的24 h增殖率明显升高(P<0.05),但联合SOD干预后三种细胞的24 h增殖率无明显变化。结论：三聚氰胺本身对肾脏近端、远端小管上皮细胞及膀胱上皮细胞的毒性较低,但高剂量三聚氰胺也可导致明显的细胞损伤,该种细胞毒性涉及氧化应激和凋亡机制。抗氧化剂过氧化氢酶和甘露醇可对三聚氰胺所致的肾脏近端、远端小管上皮细胞及膀胱上皮细胞的增殖毒性有保护作用。第四部分：三聚氰胺所致婴幼儿泌尿系毒性效应机制的探讨目的：探讨三聚氰胺毒奶粉引发婴幼儿泌尿系结石及肾损伤发生机制。方法：0.3%、1%及3%三聚氰胺饲料分别喂食雄性SD大鼠4周,探讨三聚氰胺对尿液中结石形成相关因素、泌尿系结石的发生及肾损伤的影响。采用氧嗪酸钾与尿酸注射大鼠腹腔制造高尿液尿酸大鼠模型,1%三聚氰胺饲料喂食该模型大鼠4周,探讨尿液尿酸对三聚氰胺引发泌尿系结石与肾损伤的影响。1%三聚氰胺联合半量蛋白含量的饲料喂食大鼠4周,探讨低蛋白饮食对三聚氰胺引发泌尿系结石与肾损伤的影响。1%三聚氰胺联合0.01%三聚氰酸饲料喂食大鼠4周,探讨三聚氰胺掺杂微量三聚氰酸对三聚氰胺引发泌尿系结石与肾损伤的影响。正常饲料喂食大鼠4周为阴性对照。所有大鼠处死前收集24 h尿液,检测尿液中与结石形成的相关因素。处死后,留取血液检测血电解质与生化相关指标,分析结石成分,及肉眼和显微镜下观察肾脏组织的损伤情况。结果：3%三聚氰胺饲料喂食大鼠后,相比正常饲料喂食组,24 h尿液量及钙浓度明显升高,草酸及枸橼酸浓度明显下降,pH、尿酸及磷酸离子浓度则无明显改变,肾脏功能与组织损伤明显加重。1%三聚氰胺喂食高尿液尿酸模型大鼠后,肾脏实质内见晶体沉着,肾脏功能及组织损伤程度明显重于1%三聚氰胺喂食大鼠。1%三聚氰胺联合半量蛋白饲料喂食大鼠后,肾脏组织损伤程度较1%三聚氰胺饲料喂食大鼠略重。1%三聚氰胺与0.01%三聚氰酸联合喂食大鼠后,肾脏实质内见晶体沉着,肾脏功能及组织损伤程度明显重于1%三聚氰胺喂食大鼠的相应指标。0.3%、1%、3%三聚氰胺饲料喂食大鼠、1%三聚氰胺饲料喂食尿液高尿酸模型大鼠、1%三聚氰胺联合半量蛋白饲料喂食大鼠、及1%三聚氰胺与0.01%三聚氰酸饲料联合喂食大鼠的结石发生率分别0、20%、50%、30%、10%及20%,第2-5组大鼠结石成分为三聚氰胺和微量尿酸,第6组结石成分为三聚氰胺为三聚氰胺,微量三聚氰酸,及微量尿酸。结论：高剂量三聚氰胺饲料喂食雄性SD大鼠1月,可引发泌尿系结石及肾损伤,并且尿液中部分结石形成相关因子的浓度明显变化。在尿液高尿酸浓度的条件下,三聚氰胺对肾脏毒性明显增强,肾脏组织内可有晶体盐沉积,但结石的发生率无明显变化。在半量蛋白饮食的条件下,三聚氰胺对肾脏毒性轻微加重,但结石的发生率无明显变化。在三聚氰胺含有较高三聚氰酸杂质的条件下,三聚氰胺对肾脏毒性明显增强,肾脏组织内可有晶体盐沉积。第五部分：三聚氰胺潜在性肾损伤和膀胱癌的研究及防治探讨目的:研究大鼠三聚氰胺长期暴露后肾脏和膀胱的损伤状况,并探讨相应的预防措施。方法：将130只断奶后雄性F344大鼠随机分为5组,分别为正常饲料组(A)、3%三聚氰胺(前24周)+正常饲料(后24周)(B)、3%三聚氰胺组(C)、3%三聚氰胺+3%茶叶组(D)、及3%三聚氰胺+0.02%染料木素组(E),每组分别为20、20、30、30、及30只,实验周期为48周。第24周,除B组外,每组处死10只大鼠。第48周处死剩余全部大鼠。处死后,留取大鼠血液作肾脏功能指标检测,称取大鼠泌尿系结石、肾脏、及膀胱重量,肉眼观察肾脏及膀胱组织形态,病理组织学观察肾脏组织的损伤情况和膀胱上皮肿瘤形成情况,FTIR和HPLC法分析结石成分。结果：第24周,C、D、E组中大鼠的平均血肌酐浓度均大于阴性对照组A(P<0.05),D组中大鼠的平均血肌酐浓度小于阳性对照组C (P< 0.05)。C、D、E组中部分大鼠肾脏实质内可见远端小管扩张,管腔内见晶体沉着,间质组织纤维化和淋巴细胞浸润。C、D、E组中大鼠尿路结石发现率为100%,90%,及100%,每组每只大鼠的平均结石重量>0.1 g,结石成分均为三聚氰胺及微量尿酸。膀胱重量系数(膀胱重量／体重)均大于阴性对照组A (P<0.05), C、D、E组中大鼠的膀胱腔内未见明显肿块,膀胱上皮细胞均明显增生(100%)。第48周,B、C、D、E组中大鼠的平均血肌酐浓度及及肾脏重量系数(双肾重量/体重×1000)均大于阴性对照组A(P<0.05,B组的平均血肌酐浓度除外),D组中大鼠的平均血肌酐浓度小于大于阳性对照组C (P<0.05), B、C、D, E组中部分大鼠肾脏实质内中可见远端管扩张,间质组织纤维化和淋巴细胞浸润,肾小球硬化,且间质组织淋巴细胞浸润及纤维化程度较第24周加重。B、C、D、E组中大鼠结石的发现率分别5%、44.4%、33.3%及52.6%,每组每只大鼠的平均结石重量<0.01 g,膀胱重量系数(膀胱重量/体重)均大于阴性对照组A (P<0.05), B、C、D、E组中膀胱癌的发现率为22.2%、72.3%、22.2%、及31.6%,B、D、及E组中大鼠膀胱肿块及膀胱癌的发现率均小于C组(P<0.05)。结论：高剂量三聚氰胺喂食断奶后雄性F344大鼠1年内可导致泌尿系结石、大鼠的肾脏功能及组织均受损、及膀胱上皮细胞癌变,其中后半年比较前半年,尿路结石自发减少或消失,大鼠的肾脏功能及组织受损加重,且增生膀胱上皮细胞发生癌变。高剂量三聚氰胺喂食大鼠半年后正常饮食半年,大鼠的肾脏功能和组织仍受损,增生膀胱上皮细胞发生癌变,但肾脏功能受损程度明显减轻及膀胱癌的发生率明显降低。高剂量茶叶喂食大鼠可减轻高剂量三聚氰胺所致肾脏功能受损程度,高剂量茶叶或微量染料木素喂食大鼠可明显降低高剂量三聚氰胺所致膀胱癌的发生率。第六章：头孢曲松泌尿系结石的理化分析及风险因素的体外研究第一节 头孢曲松泌尿系结石的理化分析(附病案报道)目的：探讨头孢曲松钠引发尿路结石的理化性质。方法：2012年4月我院收到2例头孢曲松钠引发的儿童尿路结石,其中1例为省外医院送检样本,患儿临床资料缺。另一例患儿4月初头孢曲松钠治疗5天后突发下腹痛、呕吐。B超检查：右输尿管结石。KUB检查：未见结石影,CT检查：右输尿管上段结石伴积水,保守治疗3天后结石排出,B超和IVP复查：未见结石影。采用红外光谱、扫描电子显微镜及能谱仪分析2例尿路结石的成分。结果：2例头孢曲松钠引发的儿童尿路结石样本均由头孢曲松和钙离子构成,且摩尔比为1：1。结论：头孢曲松钠可引发尿石症,该结石具有X线下不显影的影像学特征,尿路结石成分为头孢曲松钙盐。第二节 头孢曲松泌尿系结石形成风险的体外研究目的：初步探讨头孢曲松泌尿系结石形成风险。方法：根据儿童头孢曲松泌尿系结石的成分,尿液在膀胱内过夜时间,尿液中头孢曲松离子、钙离子、枸橼酸离子浓度,尿pH值范围,及尿液离子积大小设定相关参数,调查结晶时间、头孢曲松离子浓度、钙离子浓度、枸橼酸离子浓度、及pH对头孢曲松离子和钙离子在离子积为0.16 M的水溶液中晶体化的影响。溶液中减少的钙离子/总钙离子×100%作为头孢曲松钙晶体化程度的指标。结果：头孢曲松钙晶体化程度与结晶时间、头孢曲松离子浓度、钙离子浓度、枸橼酸离子浓度、及pH具有相关性,其中结晶时间、头孢曲松离子浓度、钙离子浓度的大小与头孢曲松钙晶体化程度具有正相关性,而枸橼酸离子浓度及pH的大小与头孢曲松钙晶体程度具有副负相关性。结论：头孢曲松钠治疗剂量过高、尿路梗阻、尿液成石因子异常可能促进头孢曲松钠引发泌尿系结石的形成。