类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)是人工构建的序列特异性核酸内切酶的一种,它能够识别并切割特定的DNA靶序列,造成双链断裂,并引起基因组结构的定点改变。它2010年底成功应用于基因打靶,很快成为一种比锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)更容易设计、特异性更高和毒性更低的人工核酸内切酶。本文将用举例的方法从TALEN的设计、构建及六种活性或突变效率检测方法来建立并完善TALEN平台,并从方法的难易程度及优缺点进行评估六种突变率检测方法和合适的应用范围。通过UA (Unit Assembly,单元组装)和Golden Gate Vector based Assembly方法合成TALEN质粒,并比较酶切,SSA检测系统,T7E1酶切加毛细血管电泳检测,加药T在检测以及单克隆检测等方法,比较构建及筛选的优缺点。我们成功构建了TANLEN质粒,并建立了较多的检测TALEN切割效果的方法,比较了各种方法的优缺点,找到合适的评估体系。我们推荐T7E1酶切试验作为早期筛选,选择最佳的TALEN质粒；切割双荧光报告系统可以作为后期单克隆筛选的重要的富集系统。FLT3/ITD突变是预测AML复发最重要的危险因素,能引起受体酪氨酸激酶显著而持久的活化,促进细胞增殖并抵抗凋亡。然而酪氨酸激酶抑制剂通常只能取得有限的血液学缓解,不能延长患者生存。因此,筛选FLT3/ITD突变促进白血病转化、加速疾病进展的关键基因或通路具有重要的理论和现实意义。然而FLT3/ITD突变常附加于其他具有表达谱特征的重现性遗传学异常,会对ITD突变相关基因或通路的筛选带来影响。在本次实验组,我们利用TALEN技术在白血病细胞株K562中的FLT3基因区引入或修正ITD突变,并分别从基因水平、表达水平、细胞行为学包括细胞增殖、凋亡、周期、等几个方面,以及下游基因的变化证实,该模型不仅在基因水平上有ITD的插入,同时也表达正确形式的FLT3/ITD剪切体,并具备相应的功能,引起了细胞行为学的相关变化。因此,我们成功建立了K562细胞系FLT3/ITD敲入模型。该模型有助于筛选出FLT3/ITD突变促进白血病转化、加速疾病进展的关键基因或信号通路,为解析FLT3-ITD突变的调控网络和分子机制,探寻潜在的治疗靶点提供参考。正常的FLT3在维持造血系统的正常功能有重要的作用和意义。各种恶性血液病均有有不同程度的表达FLT3。大量的AML的样本观察到FLT3基因转录水平的增加,而这增加表达也可能有助于FLT3的磷酸化及其通路的激活。恶性血液病中,FLT3表达量高的患者具有更糟的OS和更低的无事件生存率。因此,了解FLT3在恶性血液病中的作用是非常重要。本文利用TALEN技术在K562上建立FLT3半敲除模型,通过比较半敲模型机野生型的K562细胞的细胞行为学变化以及效应相关基因的变化,结果显示,半敲除FLT3基因是细胞增殖减弱,克隆形成能力下降,同时随着FLT3基因的下降,其下游相关基因BASP1,IGFBP2,MSI2,STON2,PROX1也随之下降,说明些基因与FLT3有明显的相关性。由此说明抑制FLT3可以抑制肿瘤细胞的增殖生长及克隆形成,同时抑制FLT3,也抑制BASP1,IGFBP2,MSI2,STON2,PROX1基因的表达。该模型可以帮助深入探讨FLT3在恶性血液病中的机制,同时也可为为寻找抑制FLT3基因新的靶点提供较好的平台。