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研究目的获得性免疫缺陷综合征/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是一种全球性的流行病。截至2017年,全球现存3690万感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)。联合国艾滋病规划署2018年的统计数据显示,43%HIV携带者是女性,且大多数为育龄期妇女。世界卫生组织(world health organization,WHO)建议,所有HIV 阳性孕妇和哺乳期妇女应接受抗逆转录病毒治疗。没有药物治疗的HIV感染会导致CD4+T细胞进行性减少、免疫失调、机会感染和肿瘤并发症的风险增加。恩曲他滨(emtricitabine,FTC)是一种高效且耐受良好的抗逆转录病毒核苷类药物,也是WHO推荐HIV感染的孕妇控制HIV病毒载量及降低母婴传播风险的一线抗病毒药物之一。为了降低耐药性的发生,WHO建议几种不同药理作用的抗逆转录病毒药物合用,称为高效联合抗逆转录病毒治疗。HIV感染孕妇采用高效抗逆转录病毒治疗既可以非常有效地控制母体病毒载量又可降低母婴传播的发生率,胎盘上表达着不同转运体其参与各类抗病毒药物的胎盘转运,药物合用在胎盘上可能存在药物-药物相互作用而引起胎儿侧有效药物浓度改变,即药物浓度升高引起的胚胎毒性或药物浓度下降引起的抗病毒失败。FTC为强极性化合物,尽管许多研究报道FTC的胎盘透过性良好,但其转运机制尚未阐明。本研究旨在阐明哪些转运体参与FTC透过血-胎盘屏障;探究抗逆转录病毒药物合用药物FTC-替诺福韦(tenofovir,TFV)-依法韦仑(efavirenz,EFV)是否影响 FTC 在 BeWo细胞和人原代滋养细胞(primary human trophoblast cells,PHTCs)中的积聚;考察妊娠不同时期平衡型核苷转运体1(equilibrative nucleoside transporter,ENT)1蛋白表达是否改变以预测FTC在妊娠期的转运变化。研究方法应用BeWo细胞和PHTCs进行FTC积聚实验、不同转运体抑制剂与FTC共孵育初步确定参与FTC跨膜转运的转运体、应用瞬时或稳定高表达的转运体细胞模型和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术进一步确认参与FTC胎盘转运的相关转运体,以LC-MS/MS法测定细胞内FTC浓度。应用实时定量PCR和western blotting技术,检测不同妊娠期的人和小鼠胎盘中核苷转运体mRNA和ENT/Entl的蛋白表达。通过比较TFV或EFV存在下,BeWo细胞和PHTCs中FTC积聚差异,考察TFV、EFV对FTC转运的影响。研究结果1.FTC的胎盘转运机制根据不同转运体抑制剂存在下BeWo细胞内FTC积聚量的变化结果表明,摄取转运体 ENTs、浓缩型核苷转运体(concentrative nucleoside transporters,CNTs)、有机阳离子转运体(organic cation transporters,OCTs)、外排转运蛋白乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins,MRPs)可能参与 FTC 的转运。PHTCs 的积聚抑制实验也表明,ENTs和OCTs可能参与FTC转运。2.FTC与胎盘相关转运体的相互作用首先应用siRNA转染BeWo细胞,通过敲低ENT1的表达后BeWo细胞内FTC的积聚减少,证明了 ENT1参与FTC的转运;应用ENTs抑制剂NBTI对ENT1和ENT2的选择性抑制,发现ENT2不参与FTC的跨膜转运;应用瞬时转染或稳定高表达转运体的细胞模型,证明FTC是CNT1、肉碱/有机阳离子转运体(organic cation/carnitine transporter,OCTN)1、BCRP 和 MRP 1/2/3 的底物,但不是 CNT3、OCTN2 和多药耐药蛋白(multidrug resistance protein,MDR)1 的底物。FTC 在HEK293-hCNT1细胞上的积聚呈典型动力学特征,Km和Vmax分别为162±54.1μM,201±15.2 pmol/mgprotein/min;FTC 在 MDCK-hOCNT1 细胞上的积聚呈非典型动力学特征,低浓度下(10-400 μM),Km和Vmax值分别为489±119μM和0.364±0.0709 nmol/mg protein/min;而高浓度下(800-5000 μM),Km and Vmax 分别为 13.3±1.18 mM 和 6.01±0.450 nmol/mg protein/min。3.人和小鼠妊娠不同时期胎盘上核苷转运体表达的变化,以及HIV药物联用是否会影响FTC在BeWo和PHTCs上的积聚。检测了人和小鼠不同妊娠期胎盘中核苷转运体mRNA的表达:发现与妊娠早期胎盘比较,人足月胎盘中的CNT1 mRNA显著增加,而其他核苷转运蛋白没有显著变化;而小鼠GD18胎盘上Ent1和Cnt3 mRNA表达较GD15显著下降,GD18胎盘上Ent2 mRNA表达较GD15显著增加,Cnt1/2 mRNA表达没有差异;妊娠不同时期人和小鼠胎盘中ENT/Ent1蛋白的表达均未显示明显变化;与TFV或/和EFV合用对FTC在BeWo细胞和PHTCs中的积聚未显示明显影响。研究结论我们对FTC胎盘转运的研究表明:ENT1、CNT1、OCTN1、BCRP和MRP1/2/3参与FTC的胎盘转运,结合转运体在合体滋养细胞中的定位,我们推测:(i)ENT1、CNT1和OCTN1从母体循环摄取FTC到滋养细胞;(ii)ENT1、CNT1和MRP1将FTC从滋养细胞转运至胎儿循环;(iii)BCRP和MRP1/2/3可能参与把FTC从滋养细胞外排回母体循环。TFV或/和EFV与FTC合用不影响FTC在BeWo或PHTCs中的积聚。