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紫杉醇为红豆杉植物中提取出的一种具有高效抗癌作用的天然活性化合物,对卵巢癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等具有很好的疗效。当前获取紫杉醇的方法有:从红豆杉属植物组织中提取、化学合成、半化学合成、内生真菌发酵、细胞培养。本论文在前人的研究基础上,利用植物细胞具备较强的光合成能力,而微生物具备专一性强的转化能力,建立药用植物-微生物共培养体系,通过植物愈伤组织与内生真菌共培养的方法来对紫杉醇生产新思路进行探究,以期为工业生产紫杉醇开辟新的途径,同时也为药用植物与其内生真菌共培养获取药用活性成分提供理论基础。 从南方红豆杉树皮中分离获得一株产紫杉醇的内生真菌TCN-01,依据其培养性状、显微形态观察,发现该菌与拟茎点霉属(Phomopsis)菌落特征类似,并利用rRNA-ITS序列分析和进化树分析,进一步发现其与拟茎点霉属(Phomopsis)相似度与同源性最高,由此确定其为拟茎点霉属(Phomopsis)真菌。并将活化的TCN-01接种到pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0,糖浓度分别为10、20、30(g/L)的PDA培养基上,分别于20、25、30、35(℃)下培养,得到该菌株最适生长条件为:温度30℃,pH7.0,糖浓度30g/L。 建立培养南方红豆杉愈伤组织的方法。将南方红豆杉外植体进行以下处理,步骤为:清水冲洗30 min,75%酒精浸泡30 s,无菌水冲洗1~2次,0.1%升汞消毒8min,无菌水冲洗6次,接种到愈伤组织诱导培养基上,黑暗培养一周后,转入1500lx,8 h/d光照下培养,30天后,统计诱导率。选取3种不同外植体(腋芽、嫩茎、叶)诱导愈伤组织,得到最佳外植体为腋芽,愈伤组织诱导率为67.1%;并对诱导培养基中添加激素组合进行优化,得到最佳愈伤组织诱导培养基配方为:MS+2.0 mg/L2,4-D+1.0 mg/L6-BA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂,pH5.8,其诱导率达到39.5%;将诱导出的愈伤组织在无菌条件下接种到增殖培养基上,并对增殖培养基中添加的激素组合进行优化。1500lx,8 h/d光照下培养30天后,计算愈伤组织增殖率及生长情况,得到最佳增殖培养基配方为:MS+4.0 mg/L NAA+2.0mg/L6-BA+0.1 g/L AC+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂,pH5.8,愈伤组织增殖率为84.1%。 利用增殖后的红豆杉愈伤组织与活化的内生真菌TCN-01进行共培养产紫杉醇研究。比较愈伤组织、内生真菌、共培养三种培养方式下,紫杉醇产量及最佳培养时间。经研究发现,在相同的培养条件下,共培养方式下的紫杉醇产量高于其他两种培养方式,并且最佳培养时间为15天;选取pH、摇床转速、马铃薯添加量、愈伤组织接种量四种因素对共培养条件进行优化,获得共培养和紫杉醇积累的最佳培养条件。当pH为6.5时,愈伤组织与内生真菌结合最好,紫杉醇产量达到123.47μg/L;当摇床转速为90 r/min时,紫杉醇产量达到122.83μg/L;当马铃薯添加量为100 g/L时,紫杉醇产量达到121.67μg/L;当接种量为90g/L时,紫杉醇产量达到120.91μg/L。以上产生量显著高于野生红豆杉植株中的正常产量。因此,本研究建立的系统,具备产业化水平应用前景。