糖尿病是一种慢性内分泌代谢疾病,是由于机体胰岛素分泌相对不足或绝对不足而引起机体糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱,并以持续高血糖为典型特征的一种综合症。世界卫生组织将糖尿病分为以下四类:1型糖尿病(Type 1 Diabetes mellitue,T1DM)、2型糖尿病(Type 2Diabetes mellitue,T2DM)、妊娠糖尿病(Gestational Diabetes mellitus,GDM)和其他糖尿病。根据国际糖尿病联盟最新统计,2019年全球约有4.63亿糖尿病患者,而我国糖尿病患者约为1.16亿,居全球首位。以目前趋势推测,到2045年全球糖尿病患者将达到7亿。目前,糖尿病最有效的治疗途径为注射胰岛素和口服降血糖药,但大多数口服降糖药具有一定的副作用。因此,寻找方便易行、疗效确切、无副作用或副作用很小的预防和治疗糖尿病的天然药物显得十分重要。拐枣(Hovenia dulcis)是一种鼠李科枳椇属植物,其可食部分为拐枣果梗。拐枣中富含植物多糖、黄酮类、三萜皂苷类和生物碱等活性成分。近年来,拐枣在营养和保健功效方面的功效越来越受到人们的重视。目前有关拐枣资源的研究主要集中在拐枣种子(枳椇子)方面,对其可食部分(拐枣果梗)的研究较少,一般为利用拐枣果梗开发拐枣果醋、果酒和果汁等产品。同时,也有少量研究报道了拐枣果梗中小分子活性物质(如黄酮类物质)的提取、分离纯化和功能方面的研究。可见,由于对拐枣果梗活性成分研究的不深入,造成其工业化产品附加值低,进而导致资源浪费等问题依然存在。因此,提高拐枣资源开发的附加值,减少资源浪费已成为拐枣产业的重中之重。基于此,本实验以拐枣(果梗)为研究对象,瞄准其活性成分拐枣多糖,采用三种提取工艺提取拐枣多糖,筛选出体外降血糖活性最高的拐枣多糖样品;并对拐枣多糖样品进行分离纯化和结构解析;以及探讨拐枣多糖纯化组分对1型糖尿病和2型糖尿病的降糖效果及机制。主要研究结果如下:(1)三种提取工艺对拐枣多糖的理化性质和结构特性及生物活性的影响采用热水提取(Hot water extraction,HWE)、快速溶剂萃取(Accelerated solvent extraction,ASE)和超声辅助提取(Ultrasonic-assisted extraction,UAE)三种提取工艺提取拐枣多糖,分别命名为:HWE-HDPs、ASE-HDPs和UAE-HDPs,探讨三种提取工艺对拐枣多糖的理化性质和结构特性以及生物活性的影响。结果显示:三种提取工艺的拐枣多糖基本化学组成成分具有显著性差异;拐枣多糖HWE-HDPs的平均分子量显著高于拐枣多糖ASE-HDPs和UAE-HDPs;拐枣多糖HWE-HDPs的单糖组成以鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖为主,拐枣多糖ASE-HDPs和UAE-HDPs的单糖组成以鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖为主;三种提取工艺的拐枣多糖均具有一定的潜在降血糖活性,其中拐枣多糖HWE-HDPs对α-葡萄糖苷酶的抑制能力和Hep-G2细胞胰岛素抵抗的改善效果均显著高于拐枣多糖ASE-HDPs和UAE-HDPs。(2)拐枣多糖的分离纯化和结构解析采用DEAE-52阴离子交换柱层析法和Sephadex G-100柱层析法对拐枣多糖进行分离纯化,得到拐枣多糖的纯化组分,对其进行纯度鉴定并测定其分子量分布,最后结合化学分析法和现代仪器分析法对多糖的纯化组分进行结构解析。结果显示:采用DEAE-52阴离子交换柱层析法分离纯化得到三个拐枣多糖组分(HDPs-1,HDPs-2和HDPs-3),其中HDPs-2的纯化得率和α-葡萄糖苷酶的抑制能力最高;进而对HDPs-2进行Sephadex G-100柱层析,得到单一多糖组分HDPs-2A,其得率为粗多糖HDPs的19.63%;HDPs-2A平均分子量为372.91 k Da,其总糖含量为84.22%,糖醛酸含量为5.35%,不含蛋白质;HDPs-2A的单糖组成主要包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等,摩尔百分比分别为:3.64%、1.41%、4.67%、5.16%、3.01%、60.02%和22.09%;高碘酸氧化、Smith降解、甲基化和核磁共振分析结果表明,HDPs-2A是由α-L-Araf-(1→、→3,5)-α-L-Araf-(1→、→3)-α-L-Araf-(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→、→3)-β-D-Galp A-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、α-D-Glcp A-(1→和→6)-α-D-Glcp-(1→等8种糖苷键组成;原子力显微镜结果表明,HDPs-2A在水中呈不规则的聚合物颗粒形态;X-RD结果表明,HDPs-2A呈单晶体结构存在。(3)拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病的降糖效果及机制研究以拐枣多糖HDPs-2A为研究材料,采用链脲佐菌素(STZ)诱导构建T1DM大鼠模型,将实验大鼠随机分为6组(每组8只):空白对照组(NG)、模型组(DM)、阳性对照组(MET)、拐枣多糖HDPs-2A低(L-PA)、中(M-PA)、高(H-PA)剂量组,分别灌胃干预4周。结果显示:中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可提高T1DM大鼠的体重、血清胰岛素水平和肝糖原水平,降低T1DM大鼠的空腹血糖水平,并改善其口服葡萄糖耐量能力;此外,中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A还能部分修复胰岛β-细胞损伤,减轻胰腺氧化应激反应,降低血清促炎因子水平;高剂量的拐枣多糖HDPs-2A对T1DM大鼠的降糖效果与MET组无显著性差异;实时荧光定量PCR和Western Blotting结果表明,1)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显著上调胰腺中PDX-1的表达,激活并上调IRS2的表达,以调控胰岛β-细胞的凋亡和再生,达到恢复胰岛β-细胞功能损伤的作用,此外,中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A也可上调胰腺GK和GLUT2的表达,以提高胰岛β-细胞的胰岛素分泌能力,最终改善T1DM大鼠的糖代谢紊乱;2)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显著上调肝脏中GK的表达,显著下调G6Pase的表达,以提高肝糖原合成能力,抑制肝脏糖异生作用,最终改善T1DM大鼠的肝脏糖代谢紊乱。综上,拐枣多糖HDPs-2A对T1DM的降糖机制可能为:通过上调胰腺PDX-1、IRS2、GK和GLUT2等信号分子的表达,以调控胰岛β-细胞的凋亡和再生,促进胰岛素分泌,同时也可通过上调肝脏GK的表达和下调G6Pase的表达,来改善肝脏糖代谢紊乱,最终达到改善T1DM的作用。(4)拐枣多糖HDPs-2A对2型糖尿病的降糖效果及机制研究以拐枣多糖HDPs-2A为研究材料,采用高脂高糖结合小剂量STZ诱导构建T2DM大鼠模型,分组与T1DM的降血糖实验一致,灌胃干预4周。结果显示:中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可提高T2DM大鼠的体重和肝糖原水平,降低T2DM大鼠的空腹血糖水平,并改善其口服葡萄糖耐量能力,提高胰岛素的利用和降低胰岛素抵抗,此外,中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A还可部分修复肝脏组织损伤,减轻肝脏氧化应激反应,并提高T1DM大鼠粪便中的短链脂肪酸(SCFAs)水平;高剂量的拐枣多糖HDPs-2A对T2DM大鼠的降糖效果与MET组无显著性差异;实时荧光定量PCR和Western Blotting结果表明,1)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显著上调T2DM大鼠肝脏中Ins R和IRS2的表达,激活PI3K,进一步激活并上调PI3K下游关键信号分子Akt的表达,从而上调肝脏中GLUT4的表达,以促进T2DM大鼠肝脏对葡萄糖的吸收和利用,同时提高肝脏的胰岛素敏感性,最终降低肝脏胰岛素抵抗;2)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显著上调T2DM大鼠肝脏p-AMPK的表达,激活AMPK途径,进而下调AMPK途径介导的糖异生关键酶G6Pase与PEPCK的表达,以抑制肝脏糖异生作用,最终改善肝脏糖代谢紊乱;3)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显著下调T2DM大鼠肝脏中糖原合成酶激酶GSK-3β的表达,并上调糖原合成酶GS的表达,以促进肝糖原合成,还可显著下调肝脏糖异生关键调控因子Fox O1的表达,以抑制肝脏糖异生作用,减少肝糖输出,最终改善肝脏糖代谢紊乱并降低肝脏胰岛素抵抗;4)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显著上调T2DM大鼠肝脏中PPARγ和PGC-1α的表达,激活PPARγ/PGC-1α信号通路,进而上调PI3K-p85和GLUT4的表达,以及激活AMPK途径和调控与糖代谢相关激酶的表达,以提高葡萄糖的转运,促进肝糖原合成,最终改善肝脏糖代谢紊乱并降低肝脏胰岛素抵抗。综上,拐枣多糖HDPs-2A对T2DM的降糖机制可能为:通过激活胰岛素PI3K/Akt信号转导通路的上下游相关信号分子,降低肝脏胰岛素抵抗;另外,通过激活AMPK途径和糖代谢相关酶,改善肝脏糖代谢紊乱;同时,也可通过调控GS/SGK-3β信号通路和下调Fox O1的表达,改善肝脏糖代谢紊乱并降低胰岛素抵抗;还可通过调控PPARγ/PGC-1α信号通路,进而调控其他相关信号分子的表达,改善肝脏糖代谢紊乱并降低胰岛素抵抗。因此,拐枣多糖HDPs-2A可改善肝脏糖代谢紊乱并降低肝脏胰岛素抵抗,且两种机制相互调节,共同改善T2DM。结论:本实验以拐枣多糖的降血糖活性为出发点,首先对拐枣多糖进行提取、分离纯化和结构解析,然后探讨拐枣多糖HDPs-2A对1型/2型糖尿病的降糖效果及机制。实验结论为:采用三种提取工艺提取拐枣多糖,其中HWE-HDPs具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性和Hep-G2胰岛素抵抗细胞改善作用;以HWE-HDPs为研究材料,经分离纯化得到拐枣多糖纯化组分HDPs-2A,其主要含α-L-Araf-(1→、→3,5)-α-L-Araf-(1→、→3)-α-L-Araf-(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→、→3)-β-D-Galp A-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、α-D-Glcp A-(1→和→6)-α-D-Glcp-(1→等8种糖苷键;然后以拐枣多糖HDPs-2A为研究材料,发现拐枣多糖HDPs-2A对T1DM的降糖机制可能为:通过调控T1DM大鼠胰腺相关基因的表达,来调控胰岛β-细胞的凋亡和再生以及促进胰岛素分泌,还可通过调控肝脏糖代谢相关酶的表达,以改善T1DM大鼠肝脏糖代谢紊乱,最终达到改善T1DM的作用;拐枣多糖HDPs-2A对T2DM的降糖机制可能为:通过激活胰岛素PI3K/Akt信号转导通路以及肝脏糖代谢相关的通路和信号分子的表达,以改善肝脏糖代谢紊乱并降低肝脏胰岛素抵抗,最终改善T2DM。