论文部分内容阅读
研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）基因组高度变异,依据核酸序列的差异,HCV可分成8种基因型和90多种亚型。HCV各基因型具有明显的地理分布差异,基因型1、2和3型呈全球性分布,其它基因型呈区域性流行。我国各地HCV基因型分布差异较大:北方地区以1b和2a亚型为主,南部地区出现3a、3b和6a亚型显著增高现象。本课题组曾于2004-2011年间对广州地区献血人群的HCV流行情况进行调查,发现6a亚型的比例约为35%,明显高于国内其它地区,调查同时显示在非广东地区人员中6a的比例存在快速上升的现象。HCV基因型分布可能受传播途径改变影响。我国在无偿献血法颁布前,HCV主要通过被污染的血液制品或献血过程传播,HCV感染者大多为1b亚型。近年来,随着无偿献血法地实行和严格的血液筛查,输血传播HCV的风险大幅下降。而性开放、纹身等生活方式相关途径,尤其是静脉吸毒传播HCV的风险却大大增加。与输血途径感染者大多为1b亚型不同,静脉吸毒HCV感染者以6a或3a亚型为主,主要感染途径的转变可能导致HCV基因型分布发生改变。另外,全球贸易和文化交流使得不同地区的人员往来更加频密,不同地区的优势或独特基因型可能由于人员流动而在本地形成传播,进而影响基因型分布情况。研究某一特定地区HCV基因型的分布降有助于了解该地区人群中HCV的传播趋势,寻找可能的高危传染源及传播途径,从而进一步采取有效的预防措施。广州地区的HCV基因型分布现状及变化趋势尚不清楚,因此我们开展了本次研究工作。此外,研究HCV主要免疫相关蛋白的序列特征,可以为免疫逃逸研究、预防性疫苗设计提供理论基础。E1蛋白位于HCV病毒颗粒表面,介导病毒入侵,也是宿主免疫系统攻击的主要目标之一,能引起较强的体液免疫和细胞免疫。E1蛋白一直是研究HCV功能和疫苗设计的热点区域,但由于其高度突变的特点以及难以独立表达等原因,其结构尚不十分清楚。本地区E1蛋白的分子结构特点鲜见报道。因此,本研究重点关注了 HCV包膜蛋白E1,通过扩张获取E1胞外域部分序列的核苷酸信息,在基因分型的基础上,进行广州地区主要基因型E1氨基酸序列的变异情况及高度突变位点替换模式分析,进一步了解E1蛋白的结构特点。目的1、获取广州地区献血人群HCV基因型信息,研究HCV基因型在特定地区或特定人群的分布特点,了解HCV基因型变化趋势。2、了解广州地区HCV主要流行基因型E1蛋白胞外域氨基酸序列结构特征。方法1、收集2012-2019年在广州血液中心献血的1988例HCV抗体阳性样本及其人口学信息,进行HCV RNA检测,随机抽取核酸阳性样本800例进行基因分型。2、提取HCV RNA,逆转录为cDNA,对其E1基因序列进行巢式PCR扩增,扩增阳性的PCR产物进行测序获得核苷酸信息,样本序列与参考序列构建系统进化树确定基因分型。3、分析广州地区HCV基因型分布情况;比较不同性别、年龄、地区人群的HCV基因型分布差异;分析2004年以来广州地区HCV基因型变化趋势。4、分别构建广州地区HCV 1b和6a亚型优势参考序列;将样本序列及优势参考序列编译成氨基酸。5、运用生物信息软件对HCV 1b和6a亚型的E1蛋白胞外域序列进行氨基酸突变和替换模式分析。结果1、2012-2019年共收集HCV抗体阳性样本样本1988例,进行核酸检测,结果HCV RNA阳性1360例。2、800例HCV核酸阳性样本进行基因分型,738例分型成功。本研究共检测到7种基因亚型,归属于5种基因型。其中包括6a亚型314例（42.55%）、1b亚型 293例（39.70%）、3a亚型49例（6.64%）、3b亚型 37例（5.01%）、2a亚型33例（4.47%）、1a亚型11例（1.49%）和4a亚型1例（0.14%）。3、18-25岁年龄组中,1b亚型的比例较高（74.00%）,与其它年龄组相比,差异有统计学意义（χ2=91.91,P<0.01）。4、2004-2007年、2008-2011年、2012-2015年和 2016-2019年四个时期中,广州地区的6a亚型呈上升的趋势;按感染者来源地进行分组,非广东人群6a比例由2004-2007年间的10.47%上升至2016-2019年间的37.38%,差异有统计学意义（χ2=21.01,P<0.01）。5、1b和6a亚型E1蛋白192-320aa发生突变的氨基酸位点分别为71个（55.00%）和79个（61.24%）,差异没有统计学意义（χ2=1.27,P=0.74）。6、E1胞外域突变主要发生在192-260aa区段,1b型的高度突变位点比较分散,6a型集中在231-243aa区段。7、17个高度突变位点均位于表位区内,其主要氨基酸替换类型为BLOSUM评分≥0的保守替换。8、E1蛋白糖基化位点N196、N209和N305未见突变发生,N234和N250突变率较低（1.37-6.69%）。结论1、广州献血者中HCV 6a呈现流行上升趋势,在2016-2019年间6a取代1b成为最主要的基因型。2、在不同年龄、性别、地域人群中,HCV基因亚型分布差异显著。3、HCV 1b和6a两种基因型的包膜蛋白E1氨基酸突变率没有显著性差异,突变主要发生于192-260aa区域。4、包膜蛋白E1的糖基化位点大部分高度保守。