论文部分内容阅读
人粒细胞无形体病（Human granulocytic anaplasmosis，HGA）是一种新发蜱传人兽共患传染病，发病病原嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）是一种专性胞内寄生菌，革兰氏阴性，可寄居于哺乳动物细胞中,也可生活在硬蜱中并传播。人粒细胞是嗜吞噬细胞无形体生存、繁殖的重要场所。HGA临床表现有发热、头痛、肌痛、白细胞减少和血小板减少、肝酶活性水平升高等，与某些病毒性传染病极其相似，极易发生误诊，重症者可引起死亡。家畜（马、犬和反刍动物）粒细胞无形体病临床症状跟HGA基本相似。嗜吞噬细胞无形体经蜱叮咬进入机体后主要存在于粒细胞中，形成含菌包涵体，且不会被溶酶体融合，扰乱宿主细胞免疫功能，有利于胞内生长繁殖。嗜吞噬细胞无形体侵入粒细胞过程中，其表面膜蛋白最先与宿主细胞发生相互作用，完成细菌侵入机体的黏附内吞过程；嗜吞噬细胞无形体进入粒细胞后，一些分泌蛋白、包涵体膜蛋白等对病原的包内寄居有重要作用，但其分子致病机理尚不完全清楚。近年来粒细胞无形体病特别是HGA案例世界范围内有增加趋势，引起世界各国的广泛关注。我们对我国人粒细胞无形体病（HGA）流行病学进行了调查，临床表现为重症型。本文拟对我国部分地区无形体病流行情况进行调查，并对人粒细胞无形体致病过程中的表面蛋白、分泌蛋白作用进行了探讨。本研究开展如下工作：1.了解云南曲靖、山西吕梁两省/市鼠传无形体流行特征。无菌条件下收集的鼠脾脏样本用组织破碎仪破碎后试剂盒抽提基因组，巢式PCR检测疑似阳性产物送测序并进行序列信息分析。研究结果表明，云南曲靖优势鼠种为褐家鼠和黄胸鼠，立克次体总阳性率为1.7%，细菌有立克次体属（Rickettsia）、埃立克体属（Ehrlichia）、无形体属（Anaplasma）、沃尔巴克体属（Wolbachia）等多个种属，提示中国云南曲靖鼠类自然感染病原种类较复杂，变异较大。山西吕梁优势鼠种为黑线姬鼠，立克次体总阳性率为5.9%，立克次体种类仅有查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）。由此得出结论是云南曲靖、山西吕梁两地区啮齿动物中存在立克次体自然感染现象，啮齿动物可能是该地区立克次体病原的一个自然疫源宿主。2.构建人单核细胞白血病细胞（THP-1）cDNA文库。提取人单核细胞白血病细胞THP-1总RNA，反转录获得第一链cDNA, LD-PCR扩增获得双链cDNA，用CHROMASPIN+TE-400纯化柱纯化的双链cDNA与pGADT7-Rec载体共转化酿酒酵母Y187，构建cDNA文库。得到了人THP-1细胞cDNA文库的库容为4.0×106，重组率为96.1%，插入片段大小在100-3000bp，且片段条带丰度位于500-2000bp之间，已达到建库要求。为进一步筛选与嗜吞噬细胞无形体LZ-HGA-Agent MSP2蛋白、Ats-1蛋白相互作用的THP-1细胞潜在蛋白奠定了基础。3.筛选与中国人源嗜吞噬细胞无形体分离株LZ-HGA-Agent Msp2、Ats-1相互作用的人THP-1细胞潜在靶蛋白，为无形体分子致病机理研究提供实验数据。以中国人源嗜吞噬细胞无形体分离株LZ-HGA-Agent表面膜蛋白Msp2、分泌蛋白Ats-1和人THP-1细胞为主要研究对象，通过生物信息学分析，选择编码Msp2蛋白完整开放阅读框、Ats-1蛋白部分开放阅读框作为克隆目标，通过引物设计，PCR扩增目的基因msp2、ats-1，连接等构建诱饵质粒pGBKT7-msp2、pGBKT7-ats-1并转化酵母Y2HGold菌株，最后经自激活检测和毒性检测证实成功构建含诱饵质粒的酵母转化子；采用研究蛋白-蛋白互作的酵母双杂交经典技术筛选互作蛋白。以上研究结果表明，筛选到与表面蛋白Msp2互作的THP-1细胞潜在蛋白主要有NADH脱氢酶（泛醌）1α亚体13（NDUFA13）、锌指蛋白36,C3H样2（ZFP36L2）、核糖体蛋白L11（RPL11）、前胸腺素α（PTMA）、Homo sapiens chromosome19open reading frame10（C19orf10）、组织蛋白酶G（CTSG）、核糖体蛋白S25（RPS25）七个阳性潜在蛋白，而与分泌蛋白Ats-1互作的THP-1细胞潜在蛋白主要有真核翻译延伸因子1α1亚基（EEF1A1）、金属蛋白酶抑制子1（TIMP1）、锌指蛋白36,C3H样2（ZFP36L2）、半乳糖凝集素1（LGALS1）、前胸腺素α（PTMA）、Homo sapiens Williams Beuren syndrome chromosome region22（WBSCR22）、吸引素（ATRN）七个阳性潜在蛋白。4.鉴定与Msp2、Ats-1蛋白真正互作的靶蛋白。为了进一步鉴定筛选到的中国人源嗜吞噬细胞无形体分离株表面蛋白Msp2、分泌蛋白Ats-1互作的THP-1细胞真正潜在蛋白，利用免疫共沉淀技术、Western blot技术验证部分互作蛋白。研究结果表明，最终验证嗜吞噬细胞无形体分离株表面蛋白Msp2与THP-1细胞的组织蛋白G（CTSG）、锌指蛋白36,C3H样2（ZFP36L2）蛋白发生相互作用；分泌蛋白Ats-1与THP-1细胞的半乳糖凝集素1（LGALS1）、金属蛋白酶抑制子1（TIMP1）蛋白发生相互作用。总之，本研究检测到云南曲靖、山西吕梁鼠类中立克次体病原分布情况，证实了云南曲靖地区存在多种立克次体病原，研究结果可以为上述两地区立克次体病防控提供指南；同时本研究成功筛选到中国人源嗜吞噬细胞无形体分离株Msp2、Ats-1蛋白相互作用的THP-1潜在蛋白，这些潜在蛋白可能跟中国人源嗜吞噬细胞无形体分离株侵入、胞内寄生相关，这为进一步研究中国人源嗜吞噬细胞无形体分离株侵入、胞内寄生等分子机制提供了科学数据，也为人粒细胞无形体病的治疗乃至新药物研发奠定必要的基础。