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近年来,我国优势流行的猪流感病毒是欧亚类禽H1N1,且该亚型病毒频繁与其他流感病毒重组,不断地感染猪群造成经济损失,甚至出现感染人的病例,威胁公共卫生安全。同时,猪在流感病毒的生态学中扮演着“混合器”的作用,其呼吸道上皮分布有α-2,6和α-2,3两种唾液酸受体,既可感染哺乳源也可感染禽源流感病毒。相关研究显示,自1998年以来我国各地多次发生猪感染H9N2禽流感病毒的事件;而当前国内禽群中占据主导地位的H9N2病毒为S基因型,其频繁地为H7N9、H10N8、H5N6等可致人感染的禽流感病毒提供全套内部基因。因此,当猪群中同时存在欧亚类禽H1N1和S基因型H9N2病毒时,两者极有可能发生基因片段的重配并产生出内部基因盒完全来源于H9N2的新型重组H1N1病毒,有必要对其基本生物学特性及可能感染人的潜在风险进行评估并探讨相关的分子机制。1、含H9N2禽流感病毒内部基因盒重组H1N1猪流感病毒的构建及对小鼠的致病性选取欧亚类禽 H1N1 病毒 A/swine/Jiangsu/01/2016(H1N1)[JS/01]和 S 基因型 H9N2病毒A/chicken/Jiangsu/CZ73/2014(H9N2)[CZ/73],分别构建其反向遗传质粒,并将CZ/73(H9N2)的 PB2、PB1、PA、NP、M、NS 这 6 个内部基因与 JS/01(H1N1)的 HA 和NA基因进行定向重配,拯救出含H9N2内部基因盒的重组H1N1病毒rH1N1/H9N2。体外实验表明,相较于2株母本病毒,重组病毒rH1N1/H9N2感染MDCK细胞引起的早期凋亡百分比更高,从而表现为更低的TCID50和更弱的细胞中复制能力;但rH1N1/H9N2病毒在MDCK细胞中形成的空斑直径更大,提示其对细胞的侵袭能力更强。进一步以鼻腔途径接种BALB/c小鼠进行体内感染性实验,rH1N1/H9N2病毒的MLD50为105.0EID50,对小鼠呈中等致病力;而2株母本病毒的MLD50均大于106.5EID50,为低致病力。当106.0EID50剂量攻毒时,rH1N1/H9N2病毒可导致80%的感染小鼠死亡,而母本病毒组的小鼠均存活。在感染后第1、3、5天,rH1N1/H9N2组小鼠的肺脏病毒滴度较JS/01(H1N1)组均显著升高,但和CZ/73(H9N2)组相比无明显差异。肺脏病理切片分析显示,在感染后第5天,rH1N1/H9N2组小鼠的肺脏病变严重程度均明显强于2株母本病毒。经转录组测序和荧光定量PCR验证,重组病毒rH1N1/H9N2感染小鼠肺脏中与炎症相关的 GlyCAM1、CR2、CD19、CD22、CXCR5、CD79a、H2-Ob、H2-Oa等基因表达水平显著增加。因此,S基因型H9N2病毒全套内部基因的引入显著增强了重组H1N1猪流感病毒对小鼠的致病力。2、含H9N2禽流感病毒内部基因盒重组H1N1猪流感病毒对小鼠致病力增强的分子基础研究为进一步解析重组病毒rH1N1/H9N2对小鼠毒力增强的分子基础,我们进行了如下两部分实验:一方面,在rH1N1/H9N2病毒骨架上逐步减少源自CZ/73(H9N2)病毒的内部基因来构建重组病毒,鉴定导致毒力增强的基因组合;另一方面,构建单个内部基因片段源自CZ/73(H9N2)的重组H1N1病毒,明确单基因替换是否对病毒致病力造成影响。重组病毒相继拯救成功,表明欧亚类禽H1N1病毒和S基因型H9N2病毒间具有较好的基因组兼容性。小鼠致病性实验显示,至少包含CZ/73(H9N2)病毒PB1和 PA 基因组合的 rJS/01-RNP+M、rJS/01-RNP+NS、rJS/01-RNP、rJS/01-PB2+PB1+PA、rJS/01-PB1+PA+NP和rJS/01-PB1+PA这6株重组病毒,以及仅含有CZ/73(H9N2)病毒NP基因的重组病毒rJS/01-NP,均可导致感染小鼠体重明显减轻;其中rJS/01-PB1+PA和rJS/01-NP病毒均可致死部分小鼠,且前者的致病性强于后者,但两者均弱于rH1N1/H9N2病毒。以上7株重组病毒的体外实验显示,rJS/01-PB1+PA和rJS/01-NP病毒在MDCK、CEF、A549细胞中的复制能力较其他5株病毒均更强或相当;但聚合酶活性的测定结果中,仅rJS/01-PB 1+PA+NP病毒显著升高,而包括rJS/01-PB1+PA和rJS/01-NP在内的其他6株病毒均明显降低,推测可能与RNP相关蛋白的表达量减少有关。以上结果表明,在S基因型H9N2病毒全套内部基因增强重组H1N1猪流感病毒对小鼠致病力的过程中,PB1与PA基因组合、NP单基因均发挥关键作用,且6个内部基因间可能还存在一定的协同作用,但具体机制仍有待深入探究。综上所述,本研究对HA和NA基因源自欧亚类禽H1N1流感病毒而内部基因全部源自S基因型H9N2病毒的重组H1N1猪流感病毒进行了哺乳动物致病性的评价与相关分子基础的鉴定。研究结果将为人感染猪流感病毒的疫情预警及S基因型H9N2充当新型流感病毒内部基因供体的机制解析提供理论参考。