高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是一种高度保守的非组蛋白,在多种生物细胞内均有表达。HMGB1主要由三个结构域构成,包括两个HMG box结构(box A和box B)和酸性氨基酸富集的羧基末端结构域(C-terminaldomain,CT)。跟组蛋白相似,HMGB1也是一种重要的染色质蛋白。在细胞核内,HMGB1可以与核小体、转录因子以及组蛋白相互作用,从而参与转录调控。细胞外的HMGB1作为一种危险信号分子,有促炎细胞因子的作用。它可以从骨髓细胞主动分泌或从多种受损的坏死细胞被动分泌到细胞外。血清的HMGB1含量升高常见于细菌性炎症、癌症、脓毒症和自身免疫病,往往代表着不良的预后。通过破坏细胞,超氧化物以及过氧化硝基盐促进HMGB1的释放。脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征,仍然是目前临床危重患者的重要死因之一,其死亡率高达30～70%。过去十几年中临床利用肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白细胞介素 1(interleukin-1,IL-1)拮抗剂治疗都未取得满意效果,这是因为这些因子通常在发病早期释放,至晚期病人病情持续加重甚至死亡时,其水平已恢复正常。研究表明,HMGB1作为重要的晚期炎症介质在全身炎症反应过程中起重要作用。致炎刺激脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等激活的单核/巨噬细胞和内皮细胞经8～32 h延迟后释放HMGB1,同时坏死组织细胞崩解也释放出大量的HMGB1。释放到细胞外的HMGB1分子通过进一步激活单核或内皮等细胞,引起大量炎症因子和黏附分子的表达和释放,导致并参与了包括脑组织、肺、胃肠道、关节、心脏等多种脏器的炎症损伤以及广泛的全身性炎症反应甚至死亡。由此可见,HMGB1在炎症反应过程中起着重要的作用。对脓毒症及其发展为多器官功能衰竭与脓毒症休克的发病机制的研究已近半个多世纪,然而对活性氧、一氧化氮、补体系统和细胞因子在其分子发病机制上的复杂作用依然有很多争论的地方。新近的研究表明,HMGB1的活性很大程度上依赖于其氧化还原状态:促炎活性的HMGB1需要其形成分子内的二硫键(第23和45位的半胱氨酸)并且要求其106位的半胱氨酸处于还原状态。106位点的氧化可以阻断其刺激活性但可以促进免疫耐受。重要的是,活性氧族与活性一氧化氮的产生,可以被超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶以及过氧化物酶降解。氧化环境的修饰可以影响HMGB1的活性。未来有望通过SOD或硫化氢对氧化环境的调控,从而降低过度的炎症反应导致的组织损伤。降低HMGB1释放和化学修饰其氧化还原形式,可以改善炎症以及组织损伤。Brealey和其合作者证实了脓毒症的导致的死亡与线粒体功能紊乱有关系。另外,在长时间处于脓毒症的病人身上发现了线粒体数量的减少,提示脓毒症相关的功能紊乱可以导致线粒体自噬。在动物模型和脓毒症病人体内线粒体功能紊乱最直接的表现就是ATP含量的显著下降。通过多物种序列比对分析发现,HMGB1含有3个高度保守的、对氧化还原条件敏感的半胱氨酸,分别是第23位、45位(位于Box A)和106位(位于Box B)。已经有报道称,HMGB1的活性很大程度上依赖于这3个半胱氨酸残基的氧化还原状态。早期的研究显示在野生的氧化条件下,23位点和45位点的半胱氨酸可以形成分子内二硫键,此时106位仍为还原形式由23位点和45位点的半胱氨酸形成的分子内二硫键可以被谷氧还蛋白催化的依赖谷胱甘肽的还原反应打破。106位点半胱氨酸的突变可以扰乱其在核内的分布,该位点对HMGB1的核质穿梭起着重要作用。Tang等人的研究展示了 106位点半胱氨酸的突变可以促进其在胞质的定位,而23与45位点形成的二硫键对于HMGB1与Beclinl的结合从而启动自噬是必须的。该课题组进一步研究发现106位点突变为Ala后,较野生型HMGB1上106位点Cys处于还原状态时自噬减弱。与之相反,氧化型的HMGB1可以激活caspase-3和caspase-9,以及诱导线粒体信号通路的凋亡。该研究也提示106位点的Cys是HMGB1与TLR4结合并活化巨噬细胞释放细胞因子所必须的。基于以上认识,为了探寻HMGB1不同氧化还原形式对其内化进入细胞的影响及其诱导细胞因子释放的差异。本研究在本室保存的HMGB1野生型的原核表达载体的基础上,构建了其不同Cys的突变体,为了便于内化观察,也同时构建了融合表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的Cys突变体并纯化得到相应的融合蛋白。随后观察了其在不同氧化还原条件下在Hela细胞和Raw264.7细胞的内化情况,并做了相应的western blot检测。最后检测了融合蛋白在内化进入BMM细胞后的降解情况及其诱导BMM细胞释放细胞因子的情况。通过以上研究,我们得到了如下结论。第一、E.coli系统纯化的HMGB1的酸性末端会被部分降解,这种降解不会受半胱氨酸位点突变影响;HMGB1不同的氧化还原形式在SDS-PAGE胶上的迁移有差异:当23位和45位点的Cys形成二硫键时,其迁移较快;当这二硫键被打破时,迁移较慢。通过电洗脱的方法获取全长的HMGB1蛋白,并探寻了同时加入不同浓度氧化剂(H202)和还原剂(DTT)对其泳动的影响,发现HMGB1的硫醇型和二硫键型会随着氧化还原条件的改变而相互转化,并有可能会同时存在。第二、HMGB1的内化受氧化还原条件影响:还原条件下可以抑制内化;而Cys的突变体会导致其在Hela细胞上的内化形式发生改变。第三、分离BMM细胞,检测不同氧化还原条件下的HMGB1及其Cys突变体刺激24h后的内化的HMGB1在BMM细胞内的降解情况;也同时检测了培养上清中的TNF-α和IL-6的水平,发现23和45位点的Cys可以延缓重组的His-HMGB1蛋白在BMM细胞上的降解;并且,HMGB1野生型、其各Cys突变体以及氧化环境下的HMGB1均能促进BMM细胞分泌TNF-α和IL-6,而在还原条件下的HMGB1丧失了这种诱导细胞因子分泌的活性。HMGB1参与了失控性全身炎症反应的发生发展过程,并作为炎症反应后期重要的炎症因子,对病情转归起着关键作用。尽管已认识到HMGB1在脓毒症中具有关键作用,而且已经进行了一些研究,但其参与炎症反应作用机制的多个环节仍不清楚。本研究对其在不同氧化还原条件下的内化及促细胞因子释放情况进行了初步研究,为进一步深入探讨HMGB1行使晚期炎症介质的机制打下基础。