微孢子虫是一类专性胞内寄生的单细胞真核生物,其宿主包括了几乎所有的无脊椎动物和脊椎动物。虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）是一种主要感染对虾肝胰腺的微孢子虫,能导致对虾生长缓滞,近十年里给世界对虾养殖业带来了巨大经济损失。极管（Polar tube,PT）,作为微孢子虫特有的侵染结构,也是微孢子虫分类的一项重要指标。极管由极管蛋白（Polar tube proteins,PTPs）组成,对极管蛋白的研究将有助于我们更好地了解极管的结构与功能,为微孢子虫检测与防控提供参考。目前,来源于不同微孢子虫的六种极管蛋白已被鉴定,但对于EHP极管蛋白的鉴定研究尚为空白。本研究通过对假定蛋白EHP00＿803的序列、基因转录、蛋白表达及定位特征进行分析,证实了该蛋白即为EHP极管蛋白2（EHPPTP2）。同时,为解决EHP检测中存在的假阳性结果、监测不及时等问题,本研究以EHPPTP2的编码基因为检测靶标,构建了一种实时定量PCR结合孢子染色镜检的方法,该方法可适用于整个对虾养殖周期对EHP的检测,满足不同养殖场的需求。主要研究结果如下:1.EHP假定极管蛋白2序列特征分析利用不同微孢子虫基因座位保守性分析,筛选得到EHP假定极管蛋白2序列EHP00＿803。EHP00＿803编码基因全长855 bp,可编码284个氨基酸,具有1个保守的PTP2蛋白家族结构域（pfam17022）,以及9个潜在的O-糖基化位点。此外,该蛋白序列中还存在7个保守的半胱氨酸残基位点,推测可能与蛋白内和/或蛋白间二硫键的形成有关,有利于形成蛋白质聚合物并稳定极管的结构。蛋白质同源序列比对分析结果表明EHP00＿803与来自黄道蟹肠孢虫（Enterospora canceri）的假定蛋白（Gen Bank No.ORD94348.1）序列同源性最高,可达52%;与毕氏肠道微孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）的PTP2（Gen Bank No.EDQ31343.1）序列同源性为47%;同时EHP00＿803可比对到多种已鉴定的来源于脑炎属微孢子虫的PTP2蛋白。尽管与其它已鉴定PTP2之间的序列同源性较低,但EHP00＿803仍然表现出微孢子虫PTP2的多个保守特征:N端具有15个氨基酸的信号肽,蛋白质理论分子量为32 k Da,等电点为8.8,具有较高的赖氨酸含量。此外,基因座位分析发现,EHP假定极管蛋白2编码基因与其邻居基因的座位在多种微孢子虫中都相当保守,说明这些基因可能行使着相似且重要的功能,然而并未在EHP和毕氏肠道微孢子虫中发现极管蛋白1（PTP1）的同源基因座位。2.EHP假定极管蛋白2基因转录、蛋白表达及定位特征分析利用密度梯度离心方法,从感染EHP病虾肝胰腺中成功分离纯化获得EHP孢子。以EHP c DNA为模板进行RT-PCR扩增,得到850 bp左右的单一扩增条带,测序结果发现扩增条带序列与其基因组对应全长序列一致,无内含子,并且该编码基因在EHP孢子中可被正常转录。随后,利用p ET32a（+）载体构建原核表达重组质粒,异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl-1-thio-β-D-galactoside,IPTG）诱导重组蛋白r EHP00＿803表达,免疫小鼠制备获得鼠多克隆抗体。蛋白免疫印迹分析结果表明:r EHP00＿803鼠多克隆抗体可以特异性识别EHP孢子总蛋白中一种38 k Da的天然蛋白,该蛋白分子量稍大于预测分子量,推测蛋白质发生了翻译后修饰。刺激EHP孢子体外发芽,间接免疫荧光标记（Indirect immunofluorescence analysis,IFA）分析结果发现r EHP00＿803鼠多克隆抗体可特异性标记EHP孢子的整根发芽极管。此外,通过免疫电镜（Immunoelectron microscopy,IEM）对EHP00＿803在EHP孢子内部的定位特征进行分析,结果显示r EHP00＿803鼠多克隆抗体标记的免疫金颗粒主要分布于在EHP孢子内部的极管区域。因此,结合EHP00＿803的序列、基因转录、蛋白表达及定位等特征,证实了EHP00＿803蛋白即为EHP极管蛋白2（EHPPTP2）。3.基于EHPPTP2编码基因建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法EHPPTP2的编码基因与其它微孢子虫、对虾病原具有极低的序列保守性,因此可利用EHPPTP2编码基因序列为靶标,构建一种基于SYBR GreenⅠ的荧光定量PCR（PTP2-q PCR）检测EHP的方法。以p MD19-EHPPTP2重组质粒为标准品进行扩增,优化扩增体系和程序后得到最佳反应退火温度为60℃,Cq值（Y）与模板起始量的对数（x）之间的关系为:Y=-3.2751x+31.269,R~2=0.993,扩增效率为102%。PTP2-q PCR最低检测限度可达到1.0×10~1 copies/μL,具有较高的灵敏度;同时,PTP2-q PCR方法可有效避免与梭子蟹微孢子虫（Ameson portunus）、海伦脑炎微孢子虫（Encephalitozoon hellem）、家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）、纳卡变形微孢子虫（Vairimorpha necatrix）以及对虾常见病原溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VPAHPND)、白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）、对虾虹彩病毒（Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV）发生交叉反应,具有良好的特异性;PTP2-q PCR方法组间变异系数小于1%,体现出良好重复性。使用PTP2-q PCR方法对养殖EHP病虾肝胰腺基因组进行检测,反应Cq值范围正常,灵敏度良好,说明此定量PCR方法可进一步应用于养殖对虾感染EHP的田间检测。4.PTP2-qPCR结合镜检方法的田间应用与优化本研究收集了大量对虾养殖场来源的EHP病虾,通过苏木精-伊红染色（HE染色）、荧光增白剂染色和扫描电镜等方法对病虾肝胰腺进行观察,检测样品中的EHP孢子。结果发现:相比于其他两种镜检方法,荧光增白剂能特异性地结合微孢子虫孢子内壁上的几丁质,在紫外光照射下EHP呈现为蓝色的椭圆形孢子,此方法操作简便、成本较低,易于EHP孢子计数。比较荧光增白剂染色孢子计数与PTP2-q PCR检测结果发现,两种方法所得到的EHP量之间具有良好的对应关系:即镜检单视野计数为35-50个EHP孢子时,对应定量PCR结果为10~6copies/mg数量级;7-20个孢子对应10~5copies/mg数量级;2-6个孢子对应10~4 copies/mg数量级;1-2个孢子对应10~3 copies/mg数量级;当定量PCR结果低于10~3copies/mg数量级时,镜检视野下无法观察到EHP孢子。值得注意的是,有报道称当EHP感染量较低时,并不会引起对虾生长受阻。因此,对虾养殖田间检测即可通过荧光增白剂染色镜检方法对EHP孢子进行快速计数,估算出病虾中EHP的感染量。而对于检测灵敏度要求更高的虾苗场,则推荐直接使用本研究中的荧光定量PCR方法进行低载量EHP的检测。本研究中构建并优化的PTP2-q PCR结合镜检的方法可满足于对虾养殖全过程中对EHP的检测需求。