卵巢是哺乳动物重要的雌性生殖器官,是卵母细胞来源和类固醇性激素的主要供应者。卵泡数量减少和卵母细胞质量下降而导致的雌性动物生育能力降低一直以来备受关注,但其分子机制仍知之甚少。研究表明氧化损伤在卵巢功能下降过程中起到关键作用,其中氧化还原酶活性受到显著抑制。通过探索卵巢机能下降机制以及寻找卵巢机能下降的潜在分子标记物为提高排卵率、改善家畜低妊娠率和治疗卵巢疾病具有重要应用价值和实践意义。ERO1α是一种存在于内质网的氧化还原酶,是调控蛋白质翻译后折叠、二硫键形成的关键因子;同时,ERO1α在维持内质网稳态中也发挥重要作用。前期研究结果表明,ERO1α在卵巢中表达较高,我们推测ERO1α可能在颗粒细胞增殖过程中起重要的调控作用。因此,本研究通过免疫组化、慢病毒载体构建、Western blot、RT-qPCR、ELISA、流式细胞术和免疫荧光等技术对小鼠卵巢中的ERO1α分布以及对颗粒细胞功能的调控作用进行了研究,主要试验结果如下:(1)检测了 ERO1α在成熟小鼠全身主要器官以及正常发情周期小鼠卵巢中的表达;所测组织中,ERO1α在卵巢和子宫中表达较高;而ERO1α表达在发情周期中发情期较高,间情期较低。(2)利用GeneBank中提供的小鼠ERO1α基因CDS序列,通过慢病毒载体pCD513B-1构建了包含ERO1α CDS序列的过表达载体pCD513B-ERO1α;针对小鼠ERO1α基因设计了三条shRNA干扰序列,通过慢病毒干扰载体pCD513B-U6成功构建三条pCD513B-U6-ERO1α-shRNA慢病毒载体。经病毒包装后收集慢病毒并进行滴度测定,病毒滴度为1-10 × 107 TU/mL。(3)将得到的ERO1α过表达和干扰慢病毒感染体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞,结果表明过表达病毒能够显著提高ERO1α表达,而干扰病毒显著抑制其表达,其中pCD513B-U6-ERO1α-shRNA-3 干扰效率在 80%左右。(4)应用RT-qPCR、Western blot、流式细胞术和ELISA等方法,研究了 ERO1α在小鼠颗粒细胞生理功能的作用,研究发现ERO1α能够显著上调BCL-2/BAX的比例,下调Caspase-3和BAD,从而抑制颗粒细胞凋亡。ERO1α能够上调CYP19A1、CYP17A1、StAR和3β-HSD等类固醇激素合成关键因子的表达,从而促进颗粒细胞E2分泌。(5)应用RT-qPCR和Western blot方法,研究了 ERO1α对蛋白加工中关键氧化还原酶以及PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用,研究发现ERO1α能够显著上调PDI和PRDX4表达以及PI3K/AKT/mTOR通路中关键因子P70S6K、AKT磷酸化水平。我们推测ERO1α可能通过调控蛋白翻译以及PI3K/AKT/mTOR通路来影响卵巢颗粒细胞凋亡和激素分泌。综上所述,在正常卵泡发育过程中ERO1α表达较高表明卵泡处于正常的发育状态,为卵泡正常发育潜在标记物以及卵泡疾病治疗提供了新的研究方向,扩宽了氧化还原酶在发泡发育过程中的作用研究。