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由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum, Fg)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)，是世界范围内的重要真菌病害。赤霉病不仅造成作物减产，病原菌在侵染小麦过程中还会产生多种真菌毒素，主要为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)，严重威胁食品安全。DON不仅对动植物细胞具有毒害作用，也是镰刀菌重要的毒性因子，在镰刀菌与小麦的互作中起着十分重要的作用，可以促进镰刀菌在小麦上的扩展。本实验室前期工作中，从郑麦9023悬浮细胞系抑制差减杂交文库中筛选经DON诱导的基因，以cDNA快速末端扩增方法(Rapid Aplification of cDNA ends, RACE)克隆到4个基因TaAn，TaUn，Ta221，TaC7全长序列。其中TaAn编码ankyrin-like蛋白，TaUn是一个尚未注释的基因，TaAn和TaUn的功能均不清楚。本研究主要围绕TaAn和TaUn的功能开展研究，主要结果如下：
1.TaAn是一类新型抗菌肽，不仅能抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发、生长，还可抑制其它病原真菌。TaAn基因位于小麦3A、3B和3D染色体上，它编码一个长度为73个氨基酸的短肽，生物信息学分析预测TaAn为抗菌肽基因；二级结构预测显示，TaAn蛋白含有2个α螺旋，1个β折叠，微量热泳动分析表明TaAn具有结合DON的能力，结合常数Kd为91μM；将TaAn在大肠杆菌中表达谷胱甘肽融合蛋白，经亲和层析纯化后，能有效抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发和生长；化学合成的N端标记异硫氰酸荧光素-氨基己酸的TaAn短肽，也能够抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发和生长。流式细胞分析及荧光显微镜观察进一步表明，TaAn蛋白是通过与禾谷镰刀菌细胞膜互作，影响孢子萌发。最低抑菌肽活性分析表明，TaAn的最低抑菌浓度为96μM。此外，TaAn蛋白能抑制链格孢菌生长，表现出广谱抑菌活性。利用胚芽鞘接种方法，将纯化的TaAn蛋白与禾谷镰刀菌孢子同时接种小麦胚芽鞘，显著地降低了镰刀菌的生物量和病斑长度，生物量比对照降低了70%，病斑长度降低了72%。这些结果表明，TaAn能够有效提高小麦对镰刀菌的抗性。
2.TaUn基因位于小麦7A、7B和7D染色体上，它编码一个长度为55个氨基酸的短肽，二级结构预测显示，TaUn蛋白含有2个α螺旋，2个β折叠。将TaUn在大肠杆菌中表达谷胱甘肽融合蛋白，经亲和层析纯化后，能有效抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发和生长；化学合成的N端标记异硫氰酸荧光素-氨基己酸的TaUn短肽，也能够抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发和生长。流式细胞分析及荧光显微镜观察进一步表明，而TaUn不仅与禾谷镰刀菌细胞膜互作，还可进入细胞质中，抑制镰刀菌孢子萌发及生长。最低抑菌肽活性分析表明，TaUn的最低抑菌浓度为154μM。此外，TaUn蛋白能抑制链格孢菌生长，表现出广谱抑菌活性。利用胚芽鞘接种方法，将纯化的TaUn蛋白与禾谷镰刀菌孢子同时接种小麦胚芽鞘，显著地降低了镰刀菌的生物量和病斑长度，生物量比对照降低了59%，病斑长度降低了51%。这些结果表明，TaUn能够有效提高小麦对镰刀菌的抗性。
3.将DON诱导的基因TaAn，TaUn，Ta221，TaC7转入小麦，可提高转基因小麦的赤霉病抗性。将经DON诱导的小麦基因TaAn，TaUn，Ta221，TaC7分别构建到含有不同启动子的基因枪表达载体和农杆菌表达载体中，转化小麦感病小麦品种襄麦76，苗期接种结果表明，转基因小麦的赤霉病抗性与对照襄麦76相比提高了40%-60%。
4.通过RNA-Seq分析DON处理小麦后的差异表达基因，筛选得到5个编码PRRs蛋白的小麦基因FS2，FS3，FS7，FS12，FS15。这5个基因具有典型的胞外的LRR结构域，跨膜结构域和胞内的Ser/Thr激酶结构域。将这5个基因的Ser/Thr激酶结构域在大肠杆菌中表达的谷胱甘肽融合蛋白具有底物磷酸化活性，可以磷酸化外源底物MBP。通过SWISS-MODEL同源建模，分子对接推测FS2，FS3，FS7，FS12，FS15基因的LRR结构域具有结合DON的能力，但是FarWesternBlot试验并未得到蛋白质与DON结合的证据。此外，构建了拟南芥EMS突变体库，筛选抗DON的拟南芥突变体，共筛选了M2代拟南芥EMS突变体种子约250,000粒，并未筛选到对DON不敏感的理想突变体。
1.TaAn是一类新型抗菌肽，不仅能抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发、生长，还可抑制其它病原真菌。TaAn基因位于小麦3A、3B和3D染色体上，它编码一个长度为73个氨基酸的短肽，生物信息学分析预测TaAn为抗菌肽基因；二级结构预测显示，TaAn蛋白含有2个α螺旋，1个β折叠，微量热泳动分析表明TaAn具有结合DON的能力，结合常数Kd为91μM；将TaAn在大肠杆菌中表达谷胱甘肽融合蛋白，经亲和层析纯化后，能有效抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发和生长；化学合成的N端标记异硫氰酸荧光素-氨基己酸的TaAn短肽，也能够抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发和生长。流式细胞分析及荧光显微镜观察进一步表明，TaAn蛋白是通过与禾谷镰刀菌细胞膜互作，影响孢子萌发。最低抑菌肽活性分析表明，TaAn的最低抑菌浓度为96μM。此外，TaAn蛋白能抑制链格孢菌生长，表现出广谱抑菌活性。利用胚芽鞘接种方法，将纯化的TaAn蛋白与禾谷镰刀菌孢子同时接种小麦胚芽鞘，显著地降低了镰刀菌的生物量和病斑长度，生物量比对照降低了70%，病斑长度降低了72%。这些结果表明，TaAn能够有效提高小麦对镰刀菌的抗性。
2.TaUn基因位于小麦7A、7B和7D染色体上，它编码一个长度为55个氨基酸的短肽，二级结构预测显示，TaUn蛋白含有2个α螺旋，2个β折叠。将TaUn在大肠杆菌中表达谷胱甘肽融合蛋白，经亲和层析纯化后，能有效抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发和生长；化学合成的N端标记异硫氰酸荧光素-氨基己酸的TaUn短肽，也能够抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发和生长。流式细胞分析及荧光显微镜观察进一步表明，而TaUn不仅与禾谷镰刀菌细胞膜互作，还可进入细胞质中，抑制镰刀菌孢子萌发及生长。最低抑菌肽活性分析表明，TaUn的最低抑菌浓度为154μM。此外，TaUn蛋白能抑制链格孢菌生长，表现出广谱抑菌活性。利用胚芽鞘接种方法，将纯化的TaUn蛋白与禾谷镰刀菌孢子同时接种小麦胚芽鞘，显著地降低了镰刀菌的生物量和病斑长度，生物量比对照降低了59%，病斑长度降低了51%。这些结果表明，TaUn能够有效提高小麦对镰刀菌的抗性。
3.将DON诱导的基因TaAn，TaUn，Ta221，TaC7转入小麦，可提高转基因小麦的赤霉病抗性。将经DON诱导的小麦基因TaAn，TaUn，Ta221，TaC7分别构建到含有不同启动子的基因枪表达载体和农杆菌表达载体中，转化小麦感病小麦品种襄麦76，苗期接种结果表明，转基因小麦的赤霉病抗性与对照襄麦76相比提高了40%-60%。
4.通过RNA-Seq分析DON处理小麦后的差异表达基因，筛选得到5个编码PRRs蛋白的小麦基因FS2，FS3，FS7，FS12，FS15。这5个基因具有典型的胞外的LRR结构域，跨膜结构域和胞内的Ser/Thr激酶结构域。将这5个基因的Ser/Thr激酶结构域在大肠杆菌中表达的谷胱甘肽融合蛋白具有底物磷酸化活性，可以磷酸化外源底物MBP。通过SWISS-MODEL同源建模，分子对接推测FS2，FS3，FS7，FS12，FS15基因的LRR结构域具有结合DON的能力，但是FarWesternBlot试验并未得到蛋白质与DON结合的证据。此外，构建了拟南芥EMS突变体库，筛选抗DON的拟南芥突变体，共筛选了M2代拟南芥EMS突变体种子约250,000粒，并未筛选到对DON不敏感的理想突变体。