三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]为五加科人参属药用植物,主要药用活性成分为三七总皂苷。三七生境特殊,生长周期长,需要轮作,制约了三七产业的可持续发展。近年来,三七的市场需求逐年扩大,供需矛盾突出。三七皂苷作为防治心脑血管疾病的天然特效药物,市场潜力巨大,有必要开展三七皂苷生物合成相关的基础研究工作。转录因子(Transcription factor)对植物次生代谢途径具有“多点调控”的优势。参与萜类合成的转录因子主要包括AP2类、bHLH类、WRKY类、锌指类和bZIP类。本文根据长春花ORCA家族设计简并引物,通过同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)成功从三七悬浮细胞的cDNA文库中克隆出一个ERF类转录因子基因——PnERF,研究其与三七皂苷合成途径中多个关键酶基因启动子区域的结合情况,以及该转录因子在三七皂苷生物合成中的作用。首先,通过同源法成功从三七中克隆到ERF类转录因子基因PnERF,其开放阅读框编码266个氨基酸,分子量30.117 kDa,等电点6.09,具有典型的AP2/EREBP结构域。系统进化树和同源序列比对分析表明,PnERF蛋白编码区的DNA结合域与其它AP2类转录因子的DNA结合域具有较高的同源性,其与长春花中ERF的同源性达48%,进化树分析显示PnERF属于ERF亚家族转录因子,三维建模结果表明PnERF与拟南芥AtERF1转录因子的晶体结构相似率达71.93%。利用染色体步移技术,从三七基因组DNA中成功克隆出鲨烯环氧酶(SE)基因上游1 872 bp的启动子区段,根据人参达玛烯二醇(DS)和鲨烯合成酶(SS)启动子序列,扩增出三七DS和SS基因上游885 bp和的1 276 bp启动子区段。生物信息学分析显示,所克隆的启动子除包含启动子基本的TATA-box及CAAT-box元件外,还包含多个与激素、生物和非生物胁迫响应的顺式作用元件。为明确启动子表达的最佳启动区段,构建SE启动子3个5’端缺失片段,分别与葡萄糖苷酸酶(GUS)基因融合,同时构建DS和SS启动子融合GUS基因植物表达载体,转化烟草进行瞬时表达活性分析。经组织化学染色和GUS荧光定量分析表明,SE启动子的4个不同长度区段均显示启动活性,且启动活性随着缺失长度增加呈增加趋势,DS和SS启动子也具有启动子活性,但较SE启动子活性弱。体外凝胶阻滞实验表明,PnERF能与GCC-box顺式元件结合,且能与三七皂苷合成途径中的关键酶基因SE启动子互作,推测PnERF可能参与三七皂苷生物合成的调控。构建PnERF植物超表达载体pCAMBIA 1 300-PnERF,采用CaCl2冻融法将表达载体转入根癌农杆菌EHA105中,利用农杆菌介导法进行三七细胞的遗传转化。经潮霉素筛选,共获得13株细胞生长状态良好的细胞株系,通过基因组DNAPCR检测,确认10株细胞系为阳性细胞。从中选取6株长势较好的三七细胞株系进行转录水平分析,结果表明转基因细胞株系的皂苷合成相关重要基因PnERF、DS和SS的表达量均高于普通三七细胞株系。为了进一步明确PnERF在三七皂苷生物合成中的地位和作用,检测6株转基因阳性细胞系的总皂苷含量,结果表明转基因三七细胞株系的三七皂苷含量均有所提高。此外,检测了 3株转基因阳性细胞系中的6种主要单体皂苷含量,结果表明除了单体皂苷Rd外,其余单体皂苷含量均有所提高。在普通三七细胞系中尚未检测到单体皂苷F1和Rg3,而在转基因细胞系中这2种单体皂苷都存在,并且转双基因(PnERF和DS)细胞中,这2种单体皂苷含量显著提高。以上研究表明,PnERF转录因子在三萜皂苷生物合成途径中起重要调控作用,其表达量的提高有利于三七皂苷的积累。