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低温胁迫是影响小麦（Triticum aestivum）生长发育等常见的非生物胁迫之一。长时间或突发的低温会严重影响小麦等农作物的产量和质量。我国北方冬季寒冷,缺少越冬作物,土地利用率低,因此,开展冬小麦抗寒性机制研究,培育抗寒品种有着重要的理论和实践意义。东农冬麦1号（Dn1）是首例可在黑龙江省等高寒地区安全越冬的冬小麦品种,返青率大于85%,拥有丰富的抗寒基因资源。Micro RNAs（miRNAs）是一类主要作用于转录后水平调控,参与基因转录和蛋白翻译等过程的非编码小RNA,在植物参与各种逆境应答中发挥重要调控作用。近年研究表明,miRNAs通过调控下游基因参与植物抗寒分子途径。本研究从前期构建的Dn1四个低温节点（5°C、0°C、-10°C、-25°C）下miRNAs高通量测序数据库中筛选出显著差异表达的tae-miR444a,进一步生信预测到其靶向TaMADS57,推测冬小麦中tae-miR444a响应低温,并通过对靶基因的调控,增强了冬小麦的抗寒性。本研究通过生物信息学分析、q RT-PCR、烟草瞬时共转染、5’RACE等技术,验证miR444a与TaMADS57的靶向关系,通过酵母双杂实验和双分子荧光互补（Bi FC）验证TaMADS57与TB1的物理互作,酵母单杂实验验证TaMADS57与TaWRKY16的启动子结合,进而揭示“miR444a-TaMADS57-TaWRKY16”模块调控Dn1响应低温的作用机制,为小麦抗寒分子育种提供新基因。主要研究结果如下:（1）生物信息学分析表明,pre-tae-miR444a长度为426 bp,拥有茎环结构,且成熟序列长度为21 nt,保守性较高。通过ps RNATarget软件预测其靶基因为TaMADS57,长度726bp,编码241个氨基酸,属于亲水蛋白,其MADS、K结构域具有高度保守性,属于MADS-box家族。（2）通过构建pBI121-pre-tae-miR444a和p BI121-TaMADS57重组载体,并转化烟草瞬时共转染,结果显示两者共转化的烟草叶片,比单独转入p BI121-TaMADS57的叶片,GUS染色程度明显减弱。5’RACE验证TaMADS57存在tae-miR444a的切割位点,位于成熟序列点5’端第14和15碱基之间。上述实验证明Dn1中tae-miR444a靶向切割TaMADS57。（3）对大田自然降温下四个温度节点（5°C、0°C、-10°C、-25°C）和室内低温（22°C、4°C、-10°C）培养下的Dn1,分蘖节和叶片q RT-PCR分析结果显示,tae-miR444a表达量随温度降低逐渐上升,室内与室外分别在-10°C和-25°C时表达量最高;靶基因TaMADS57随温度降低呈现先上升后下降的趋势,室内与室外分别在4°C和0°C时表达量达到最高,TaMADS57表达量变化总体趋势与tae-miR444a趋势相反,Dn1中tae-miR444a负调控TaMADS57表达。进一步对Dn1 tae-miR444a和TaMADS57的A、B、D同源基因进行q RT-PCR分析显示,Dn1中D染色体上的tae-miR444a和TaMADS57是响应低温的主效基因。（4）成功构建了tae-miR444a过表达和STTM-tae-miR444a沉默载体。农杆菌介导花序侵染法转化拟南芥,获得过表达tae-miR444a T3代转基因拟南芥植株（OEtae-miR444a）;农杆菌介导成熟胚转化Dn1,经抗性筛选获得过表达tae-miR444a和沉默STTM-tae-miR444a T0代转基因Dn1植株。（5）低温胁迫下,检测出过表达OEtae-miR444a转基因拟南芥中相对电导率、MDA、H2O2和O2.-含量显著低于野生型（WT）,其DAB和NBT染色程度浅于WT,OEtae-miR444a转基因拟南芥在低温胁迫下表现为较高的存活率和较低的膜脂损伤。对抗氧化酶活性和相关基因表达量分析显示,OEtae-miR444a转基因拟南芥植株低温胁迫下,CAT、POD、SOD的酶活性及其基因表达量均显著高于野生型。表明tae-miR444a的过表达增强了拟南芥植株的抗寒能力。（6）酵母双杂交和Bi FC实验证明TaMADS57与TaTB1存在物理互作,且亚细胞定位实验发现TaMADS57转录因子定位于细胞核中;酵母单杂交证明TaMADS57转录因子能与TaWRKY16启动子上CAr G位点结合。q RT-PCR分析显示,Dn1和OEtae-miR444a转基因拟南芥中TaWRKY16和At WRKY21随温度降低表达显著上调,初步推测低温下Dn1中TaTB1通过增强TaMADS57与下游TaWRKY16的结合能力而抑制TaWRKY16的表达。综上所述,本研究初步揭示了低温下Dn1中“tae-miR444a-TaMADS57-TaWRKY16”模块增强冬小麦抗寒性的分子机制,即低温下tae-miR444a负调控靶向TaMADS57,使TaMADS57表达量减少,减弱了对下游抗寒相关转录因子TaWRKY16的抑制作用,进而增强了Dn1的抗寒性。本研究可为丰富作物抗寒理论和小麦抗寒分子育种提供新思路。